Morpholino下調自閉癥基因方法的建立與應用.pdf

1、目的：2014年美國疾病控制和預防中心公布的數據顯示，每68名美國兒童中有1名自閉癥患者。自閉癥兒童比例約為1.5％，比2012年公布的數據高出近30%。研究發(fā)現自閉癥是源于易感基因和環(huán)境危險因素之間的相互作用。許多在環(huán)境介質、動植物和人體中高檢出的環(huán)境污染物（如持久性有機物、重金屬和農藥等）都具有顯著的神經毒性，并與近期自閉癥患者的快速增長密切相關。
　　方法：首先選擇丙戊酸鈉(sodium valproate,VPA)作為評價

2、斑馬魚自閉癥的陽性化合物，以 VPA暴露斑馬魚所產生的一些表觀現象，作為評價斑馬魚自閉癥模型的指標。接著選取了斑馬魚16號染色體上的基因，用單細胞期注射反義寡核苷酸（Morpholino,MO）的方法對候選基因進行基因下調，再對其進行發(fā)育毒性和自閉癥譜系障礙（ASD）風險指標進行評價，從中選取了兩個效果較好的基因和 BPA聯合，研究兩者的協同作用。將親本對照組的斑馬魚與雙酚 A（Bisphenol A,BPA）暴露的斑馬魚進行交叉配對實

3、驗，通過對其子代斑馬魚的發(fā)育毒性和神經毒性的檢測來評價BPA慢性暴露對斑馬魚的影響。
　　結果：通過不同濃度的VPA暴露對斑馬魚畸形率、自主運動和頭部大小的研究發(fā)現，5μM VPA暴露胚胎，可使24 hpf自主運動次數顯著升高，頭部顯著增大，故5μM為合適的用于后續(xù)ASD相關行為學的暴露濃度。用單細胞期注射MO的方法對候選基因進行下調，再對其進行發(fā)育毒性和ASD風險指標進行評價，選取了kctd13和chd8作為后期實驗的候選基因，

4、并且確定了兩者的濃度分別是0.1 mM、0.25 mM；將這兩個候選基因下調分別急性暴露BPA，發(fā)現基因和BPA聯合處理對斑馬魚自主運動次數的增加和增大頭部尺寸具有協同作用。低劑量BPA暴露對斑馬魚的生長發(fā)育基本沒有影響，但能導致F2代斑馬魚仔魚的頭部變大；成體雄魚腦部重量的增加；腦部ASD相關基因和wnt相關基因的qRT-PCR結果顯kctd13和chd8表達下調，作為wnt信號的負調控子，chd8下調激活了wnt信號通路，使mag、