自噬在肝卵圓細(xì)胞增殖和分化中的作用研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)添加藥物雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）和氯喹（Chloroquine，Chlo）調(diào)整肝卵圓細(xì)胞的自噬水平，觀察肝卵圓細(xì)胞的增殖和分化情況改變。
　　這些：
　　一、雷帕霉素和氯喹對(duì)大鼠肝卵圓細(xì)胞自噬水平的調(diào)控作用
　　（1）用分別用40nmol/L的雷帕霉素和50μmol/L的氯喹處理肝卵圓細(xì)胞24小時(shí)后,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化,western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-I和L

2、C3-II以及P62的表達(dá)。
　　二、自噬對(duì)肝卵圓細(xì)胞在正常環(huán)境下的增殖和凋亡的影響
　?。?）分別用0（空白對(duì)照）、5、10、25、50、100、150、200、300、500μmol/L氯喹，以及25、50、100、200、500nmol/L的雷帕霉素分別處理肝卵圓細(xì)胞，每個(gè)濃度點(diǎn)設(shè)置3個(gè)時(shí)間點(diǎn)24h、48h、72h，應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)比較肝卵圓細(xì)胞的增殖能力變化。
　?。?）用分別用40nmol/L的雷帕霉

3、素和50μmol/L的氯喹處理細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞技術(shù)來(lái)檢測(cè)肝卵圓細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡細(xì)胞比例。
　?。?）肝卵圓細(xì)胞經(jīng)過(guò)40nmol/L的雷帕霉素和50μmol/L的氯喹處理后，分別提取蛋白通過(guò)western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL-2）和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（polyADP-ribose polymerase，cleave-PARP）。
　　三、自噬對(duì)

4、正常環(huán)境下肝卵圓細(xì)胞分化的影響
　?。?）大鼠肝卵圓細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,利用丁酸鈉（Sodium butyrate，SB）誘導(dǎo)分化，通過(guò)細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)觀察不同藥物處理組體外誘導(dǎo)分化改變情況。
　?。?）40nmol/L的雷帕霉素和50μmol/L的氯喹處理實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組分別提取蛋白，通過(guò)Western Blot法檢測(cè)角蛋白19(Cytokeratin19，CK19)蛋白水平
　　四、探討自噬調(diào)控肝卵圓細(xì)胞增殖和

5、分化的可能信號(hào)通路
　?。?）用40nmol/L的雷帕霉素和50μmol/L的氯喹藥物處理組和對(duì)照組，分別提取蛋白后通過(guò) Western Blot法檢測(cè)相關(guān)通路NOTCH1胞內(nèi)區(qū)域段(Notch intraCellular domain,NICD)、HES1、HES5蛋白激酶ERK和MAPK(P38)的磷酸化水平。
　　結(jié)果：
　　1.雷帕霉素能誘導(dǎo)大鼠肝卵圓細(xì)胞發(fā)生自噬，而氯喹能抑制肝卵圓細(xì)胞自噬的發(fā)生
　?。?/p>

6、1）雷帕霉素處理后細(xì)胞形態(tài)變化不明顯，而氯喹處理組細(xì)胞形態(tài)由卵圓形變?yōu)槿切?，?xì)胞數(shù)量減少。
　?。?）雷帕霉素處理后，引起LC3-II/LC3-I比值增大，P62減少。
　　（3）氯喹處理組，引起LC3-II/LC3-I比值降低，P62增多。
　　2.自噬對(duì)肝卵圓細(xì)胞在正常環(huán)境下的增殖和凋亡的影響
　?。?）氯喹處理后，肝卵圓細(xì)胞的增殖對(duì)氯喹有時(shí)間和劑量依賴性。相同處理時(shí)間，隨著氯喹濃度的升高，肝卵圓細(xì)胞的增殖

7、抑制率逐漸升高；相同處理濃度，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，肝卵圓細(xì)胞的抑制率逐漸升高。
　?。?）氯喹處理肝卵圓細(xì)胞后，細(xì)胞周期SubG1停滯增多，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多；而雷帕霉素處理組，細(xì)胞周期無(wú)顯著變化，細(xì)胞凋亡數(shù)量輕微降低。
　?。?）雷帕霉素組，引起B(yǎng)CL-2的升高，cleave-PARP降低。
　?。?）氯喹處理組，引起cleave-PARP的升高，BCL-2降低。
　　以上結(jié)果表示自噬的抑制能抑制肝卵圓細(xì)胞增

8、殖的，并且使肝卵圓細(xì)胞的周期停滯，促進(jìn)凋亡。
　　3.自噬能促進(jìn)肝卵圓細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化
　?。?）雷帕霉素處理組，相對(duì)于對(duì)照組，CK19的熒光量明顯增多，兩組均高于正常組。
　?。?）氯喹處理組，相對(duì)于對(duì)照組，熒光表達(dá)量無(wú)明顯變化。
　　（3）雷帕霉素處理后相對(duì)于正?；蛘邔?duì)照組，ck19蛋白的表達(dá)量顯著提高。
　　以上結(jié)果提示自噬能促進(jìn)肝卵圓細(xì)胞向膽管細(xì)胞的分化。
　　4.肝卵圓細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)能改變

9、notch通路和MAPK/ERK通路
　?。?）雷帕霉素能提高M(jìn)APK/ERK的磷酸化水平。
　?。?）雷帕霉素能促進(jìn)NICD、HES1/HES5的表達(dá)。以上結(jié)果表示自噬可能通過(guò)notch通路和MAPK/ERK通路調(diào)控肝卵圓細(xì)胞的增殖和分化。
　　結(jié)論
　　1.自噬的抑制能抑制肝卵圓細(xì)胞的增殖，引起周期停滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　2.自噬能促進(jìn)肝卵圓細(xì)胞的分化。
　　3.自噬對(duì)肝卵圓細(xì)胞的作用可能通過(guò)調(diào)