膝溝藻毒素GTX2,3單克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)法的建立.pdf

1、膝溝藻毒素2，3(gonyautoxin2&3，GTX2，3)是一類氨基甲酸酯類麻痹性貝類毒素(PSP)，具有分布廣、毒性強(qiáng)、對(duì)人體危害嚴(yán)重等特點(diǎn)，是我國(guó)南方沿海染毒貝類和有毒赤潮藻的主要毒素之一，嚴(yán)重威脅廣東沿海海域貝類的食用安全。本研究主要采用乙二醛作為偶聯(lián)劑將小分子GTX2，3分別與載體蛋白BSA和KLH進(jìn)行蛋白偶聯(lián)，制備完全免疫抗原和檢測(cè)抗原，通過(guò)完全抗原的偶聯(lián)鑒定、動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞株克隆化培養(yǎng)技術(shù)及小鼠體內(nèi)誘生法

2、制備抗GTX2，3單克隆抗體，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了GTX2，3間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　(1)本實(shí)驗(yàn)采用乙二醛作為偶聯(lián)劑將小分子GTX2，3分別與載體蛋白BSA和KLH進(jìn)行蛋白偶聯(lián)制備完全免疫抗原和檢測(cè)抗原，并通過(guò)BCA蛋白濃度測(cè)定、紫外掃描、變性SDS-PAGE凝膠電泳和抗原免疫原性等鑒定方法，證明成功制備了具有較強(qiáng)免疫原性的GTX2，3完全抗原，其中免疫抗原的蛋白濃度為8.52mg/mL

3、、分子偶聯(lián)比為15∶1，檢測(cè)抗原的蛋白濃度為5.72 mg/mL，通過(guò)間接ELISA檢測(cè)免疫4次后的小鼠血清效價(jià)達(dá)到1∶51200。
　　(2)分別采取足墊及腹腔注射免疫、頸背部皮下多點(diǎn)免疫、腹腔注射免疫和快速免疫佐劑肌肉注射免疫共四種不同免疫方法免疫6-8周齡健康的雌性BALB/c小鼠，最高的小鼠抗血清效價(jià)分別為1∶25600、1∶51200、1∶102400和1∶51200。摘取不同免疫方案中抗血清效價(jià)最高的小鼠脾細(xì)胞與復(fù)蘇的

4、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。采用細(xì)胞融合技術(shù)及有限稀釋克隆技術(shù)成功篩選出3株能穩(wěn)定分泌抗GTX2，3的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株2-2H11、3-2F2和3-3C9，雜交瘤細(xì)胞上清液效價(jià)分別為1∶128、1∶64和1∶256，經(jīng)小鼠單抗亞類試劑盒鑒定，抗體亞類均為IgG1。并通過(guò)小鼠體內(nèi)誘生腹水法、辛酸-硫酸銨法(CA-AS)和Protein A株親和層析純化法、BCA蛋白濃度測(cè)定、間接ELISA法和單抗亞類鑒定，最終選擇抗GTX2，3單克

5、隆抗體亞類為IgG1、抗體效價(jià)高達(dá)1∶102400、抗體的親和常數(shù)為1.05×108 L/mol的具有良好的特異性的GTX2，3-3-3C9腹水單抗，用于后續(xù)的GTX2，3間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立。
　　(3)利用抗GTX2，3單克隆抗體3-3C9建立的檢測(cè)GTX2，3間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的線性回歸方程為y=-14.821x+98.544，相關(guān)系數(shù)R2=0.9942，靈敏度(IC50)為1.653μg/mL，線性檢測(cè)范圍(I

6、C20-IC80)為0.277-9.852μg/mL，檢測(cè)限為0.1361μg/mL。用本實(shí)驗(yàn)所建立的用GTX2，3-ic-ELISA計(jì)算的香港牡蠣的加標(biāo)回收率為90.05％-113.7％，波紋巴非蛤的為94.55％-106.0％;用HPLC計(jì)算的香港牡蠣和波紋巴非蛤的加標(biāo)回收率分別為97.98％-103.3％和96.90％-101.9％。兩者的加標(biāo)回收率均在80％-120％范圍內(nèi)，說(shuō)明所建立的GTX2，3-ic-ELISA在一定濃度范