乳酸桿菌破壁方法及限制——修飾系統(tǒng)對轉(zhuǎn)化效率影響的研究.pdf

1、乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一類能夠發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生乳酸的革蘭氏染色陽性細菌的統(tǒng)稱。乳酸菌具有諸多益生功能，如:提高機體抗氧化能力延緩衰老，增加腸內(nèi)有益菌減少有害菌，治療傳染性疾病和消化道疾病，刺激機體的免疫機能，降膽固醇降血壓等?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的乳酸菌有近30個屬，包括雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（

2、Lactococcus）、片球菌屬(Pediococcus)、羅氏菌屬(Rothia)、明串菌屬(Leuconoostoc)等。乳桿菌屬、乳球菌屬等乳酸菌因能夠在胃腸道、泌尿、生殖系統(tǒng)中或粘膜部位粘附存活且無病原性等特點而尤其受到人們的重視。近十幾年來，運用基因工程技術(shù)，構(gòu)建乳酸桿菌表達系統(tǒng)表達外源蛋白以及作為新型疫苗載體等方面已引起了廣泛關(guān)注，但由于乳酸桿菌屬于革蘭氏陽性菌，細胞壁厚而致密，不僅其內(nèi)源蛋白、表達的非分泌性外源蛋白、核酸

3、以及其他非分泌性代謝產(chǎn)物的提取效率極低，而且外源DNA的轉(zhuǎn)化效率也極低，這嚴重制約了乳酸桿菌分子機制的研究和基因工程技術(shù)的發(fā)展，且要實現(xiàn)外源基因在乳酸桿菌中異源表達，首先要實現(xiàn)乳酸桿菌的高效轉(zhuǎn)化。因此，乳酸桿菌分子機制研究和基因工程發(fā)展的過程中迫切需要解決的關(guān)鍵問題是探索一種有效的乳酸菌破壁方法及提高其轉(zhuǎn)化效率。主要研究內(nèi)容分為以下2個部分:
　　1.乳酸桿菌破壁方法的探究
　　試驗通過反復凍融破壁法、溶菌酶破壁法、氧化鋯珠

4、破壁法、超聲波破壁法對植物乳桿菌Lactobacillus.plantarum1.557進行破壁處理，并以革蘭氏染色和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SD S-PAGE)為評價方法，比較破壁效果和破壁時間的差異。此外，通過β-葡萄糖醛酸酶(GUS)活力的測定對氧化鋯珠破壁法所提蛋白進行活性檢測，通過瓊脂糖凝膠電泳對氧化鋯珠破壁法所提RNA的質(zhì)量進行了檢測。結(jié)果表明:氧化鋯珠破壁法優(yōu)勝于其他幾種處理方法，該法所提取的GUS蛋白具有蛋白活

5、性，該法所提取的RNA的OD260/OD280的比值在1.8～2.1之間，符合標準的比值，純度較高，降解程度低。因此，氧化鋯珠破壁法適用于快速提取乳酸桿菌菌體蛋白和總RNA。然后，試驗在菌體重量、研磨buffer和研磨時間這3方面對氧化鋯珠破壁法進行了優(yōu)化，并通過SDS-PAGE來分析其破壁效果。在優(yōu)化后條件下，同時對6株乳酸菌進行破壁處理并通過SDS-PAGE來分析其破壁效果。結(jié)果表明:在菌體重量、研磨buffer、鋯珠三者的加入比例

6、(W/V/W)為0.013g∶300 uL∶1 g的條件下，研磨15 min，提取的蛋白圖譜條帶清晰，豐度高;RIPA、PBS、PENP、GUS作為研磨buffer時，提取的蛋白圖譜條帶清晰且豐度高，而8M尿素作為研磨buffer時，圖譜條帶模糊且豐度低;6株乳酸菌經(jīng)該方法破壁處理后，蛋白圖譜條帶均具有較高的豐度和清晰度。因此，對于乳酸菌的破壁，氧化鋯珠破壁法具有快速、高效、經(jīng)濟的優(yōu)點。本試驗所探究的成功提取乳酸菌蛋白的方法也為下一步研

7、究乳酸桿菌限制-修飾系統(tǒng)對轉(zhuǎn)化效率的影響（電轉(zhuǎn)化經(jīng)乳酸菌胞漿蛋白體外修飾的質(zhì)粒DNA）奠定了平臺基礎(chǔ)。
　　2.乳酸桿菌限制-修飾系統(tǒng)對轉(zhuǎn)化效率影響的探究
　　本研究利用電轉(zhuǎn)化方法探究了乳酸桿菌限制-修飾系統(tǒng)對電轉(zhuǎn)化效率的影響，以期提高乳酸桿菌的電轉(zhuǎn)化效率。試驗通過測定5株乳酸桿菌—植物乳桿菌(L.plantarum1.557)、植物乳桿菌(L.plantarum WCFS1)、副干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌的生長曲線

8、，來確定這5株菌的對數(shù)生長期，然后選擇處于對數(shù)生長期的5株菌分別轉(zhuǎn)接到含不同濃度甘氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并通過測定生長曲線，來探索細胞壁弱化劑（甘氨酸）的適宜濃度及加入時間，在此基礎(chǔ)上，制備5株乳酸桿菌的感受態(tài)細胞。同時，通過觀察5株乳酸桿菌在含不同濃度紅霉素的培養(yǎng)基中的生長情況來確定電轉(zhuǎn)化后用于篩選轉(zhuǎn)化子的紅霉素濃度。研究結(jié)果表明:植物乳桿菌（L.plantarum1.557）、植物乳桿菌（L.plantarumWCFS1）、副干酪乳桿菌

9、、嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌分別在12h、16h、16h、20 h、20 h時達到對數(shù)末期且分別在紅霉素濃度為0.5μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、1μg/mL時生長受到明顯抑制，2％的甘氨酸即可對這5株乳酸桿菌的細胞壁起到較好的弱化作用，有利于感受態(tài)細胞的形成。然后，在乳酸桿菌感受態(tài)細胞成功制備的條件下，試驗通過溫度處理、體內(nèi)DNA修飾、體外DNA修飾這3種方法進一步研究了乳酸桿菌限制-修飾系統(tǒng)對于轉(zhuǎn)化效率的影響。

10、研究結(jié)果表明:適宜溫度(50℃)處理乳酸桿菌可以明顯提高一些菌株(L.plantarum1.557、L.acidophilus1.1878、L.delbrueckii subsp.bulgaricus1.2161)的轉(zhuǎn)化效率，電轉(zhuǎn)入經(jīng)乳酸乳球菌體內(nèi)修飾的質(zhì)?？梢悦黠@提高一些菌株（L.plantarum1.557、L.acidophilus1.1878、L.delbrueckii subsp.bulgaricus1.2161）的轉(zhuǎn)化效率。