β-Lg過敏小鼠miRNA表達(dá)與Th17相關(guān)性及嗜酸乳桿菌的干預(yù)作用.pdf

1、牛乳富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，因此是嬰幼兒重要的食物來源。但據(jù)研究表明3％-6％的兒童對牛乳中的β-乳球蛋白(β-Lg)過敏，是亟待解決的的食品安全問題。本研究前期篩選出一株具有抗過敏性能的嗜酸乳桿菌KLDS1.0738，并發(fā)現(xiàn)該菌株可逆轉(zhuǎn)過敏炎癥中的Treg/Th17失衡，但具體機(jī)制尚不清楚。新近研究提示一類非蛋白編碼RNA-microRNA(miRNA)是腸道黏膜免疫的重要調(diào)控因子，在炎癥發(fā)生發(fā)展的Th細(xì)胞分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但miRNA表

2、達(dá)對牛乳過敏誘導(dǎo)的Th17失衡的調(diào)控作用尚未可知;益生菌與宿主腸道互作是否受特定miRNA調(diào)節(jié)也尚不明確。故本研究在以往工作基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建細(xì)胞和動物模型，首先探明β-Lg誘發(fā)過敏細(xì)胞表達(dá)miRNA的作用，其次分析β-Lg過敏小鼠臟器中miRNA表達(dá)、Th17失衡和過敏炎癥的相關(guān)性;進(jìn)一步研究miRNA參與嗜酸乳桿菌抑制Th17細(xì)胞分化的作用。本研究從miRNA水平揭示益生菌緩解過敏的免疫機(jī)制，為尋找防治過敏的干預(yù)靶點(diǎn)提供重要線索。

3、r>　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴從細(xì)胞水平分析β-Lg誘發(fā)miRNA表達(dá)的作用。首先應(yīng)用MTT試驗(yàn)分析β-Lg對小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響。發(fā)現(xiàn)終濃度為0.1、0.5、1 mg/mL的β-Lg均可促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞體外增殖，且表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。優(yōu)選終濃度為1 mg/mL的β-Lg與脾臟淋巴細(xì)胞共孵育24 h，采用RT-PCR法檢測miR-146a、miR-155、miR-21和miR-9的水平。結(jié)果顯示，β-Lg可誘發(fā)淋巴細(xì)胞顯著表達(dá)mi

4、R-155、miR-146a、miR-21和miR-9（P＜0.05），特別是miR-155、miR-146a的表達(dá)分別是空白組的7倍和5倍。⑵動物模型水平探討miRNA和Th17細(xì)胞在β-Lg過敏中的作用。雌性KM小鼠隨機(jī)分為空白組和β-Lg過敏組(n=6)。β-Lg過敏組小鼠每周1次給予腹腔注射1 mg/mL的過敏原(1mL弗氏佐劑+1 mL1 mg/mLβ-Lg)，共3周。試驗(yàn)的第21天，給予小鼠1 mg/mLβ-Lg口服激發(fā)后頸

5、椎脫臼處死。RT-PCR法檢測小鼠脾臟、結(jié)腸組織中miR-146a、miR-155、miR-21和miR-9的表達(dá);RT-PCR法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISE)檢測過敏小鼠血清和脾臟中Th17相關(guān)細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。⑶β-Lg過敏組小鼠過敏癥狀顯著，表現(xiàn)為過敏小鼠腹瀉、平均體重減輕，結(jié)腸長度與重量均下降。病理學(xué)結(jié)果顯示過敏小鼠結(jié)腸組織有明顯炎性細(xì)胞浸潤，且血液中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目和血清中IgE含量顯著高于正常組(P＜0.05)，分

6、別達(dá)到了（6.28±0.87）×109個(gè)/L和（134.78±9.51）ng/mL。⑷與空白組相比，β-Lg過敏組小鼠血清Th17細(xì)胞因子IL-17、IL-6、TNF-α和IL-21的濃度顯著升高(P＜0.05)。與此相適應(yīng)的是，過敏組小鼠脾臟中RORγt及IL-17 mRNA的表達(dá)水平也顯著高于空白組（P＜0.05）。⑸各組小鼠脾臟和結(jié)腸組織中miRNA的表達(dá)結(jié)果顯示，β-Lg過敏組小鼠miR-146a、miR-155、miR-21和

7、miR-9的表達(dá)均顯著高于空白組（P＜0.05）。與細(xì)胞模型結(jié)果一致，β-Lg過敏原激可發(fā)小鼠高表達(dá)miR-146a和miR-155。進(jìn)一步分析β-Lg過敏小鼠中Th17細(xì)胞和miRNA表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，β-Lg過敏組小鼠脾臟組織中miR-21、miR-155、miR-146a及miR-9 mRNA的表達(dá)水平與IL-17 mRNA（r分別為0.997、0.996、0,998、0,995，P＜0.05）和RORγt mRNA(r分別

8、為0.983、0,974、0.983、0.983，P＜0.05)均呈顯著性正相關(guān)。⑹細(xì)胞水平分析嗜酸乳桿菌對β-Lg過敏淋巴細(xì)胞表達(dá)miRNA的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，與ConA陽性對照組相比，嗜酸乳桿菌可抑制β-Lg過敏淋巴細(xì)胞過度增殖，特別是中、高濃度嗜酸乳桿菌抑制作用較高(P＜0.05)。同時(shí)，嗜酸乳桿菌體外刺激β-Lg過敏脾臟淋巴細(xì)胞后可顯著抑制miR-146a、miR-155、miR-21和miR-9的表達(dá)（P＜0.05），且具有

9、劑量依賴性。⑺應(yīng)用不同濃度嗜酸乳桿菌(低濃度107 cfu/mL;中濃度108 cfu/mL;高濃度109cfu/mL)干預(yù)β-Lg過敏小鼠。結(jié)果顯示，連續(xù)灌胃4周嗜酸乳桿菌后，過敏小鼠急性發(fā)作癥狀均有明顯減輕;隨著嗜酸乳桿菌濃度的增加，小鼠平均體重的凈增長顯著增加（分別為4.028±0.74 g;4.59±0.52 g;5.34±0.54 g）;結(jié)腸的長度縮短現(xiàn)象有不同程度的緩解;炎性細(xì)胞浸潤減輕，組織病理損傷評分明顯降低;并且有效降

10、低過敏小鼠血液嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量及血清中抗體水平(P＜0.05)。⑻嗜酸乳桿菌干預(yù)可顯著降低過敏小鼠血清中炎性細(xì)胞因子如IL-17、IL-6、TNF-α和IL-21的含量，抑制過敏小鼠脾臟組織中IL-17和RORγt mRNA的表達(dá)，并且高劑量嗜酸乳桿菌組的抑制效果顯著優(yōu)于低劑量組(P＜0.05)。同時(shí)不同濃度嗜酸乳桿菌干預(yù)后能顯著降低過敏小鼠結(jié)腸和脾臟組織中的miR-21、miR-155、miR-146a以及miR-9的表達(dá)（P＜0.