奧奈達(dá)希瓦氏菌株中氧化脅迫的研究.pdf

1、受到活性氧(reactive oxide species，ROS)如過(guò)氧化氫(H2O2)，超氧化物（O2-）和羥自由基(HO·)的攻擊是細(xì)菌在有氧環(huán)境中生存所面臨的共同外界壓力。在有氧條件下，細(xì)胞內(nèi)正常的生理代謝也會(huì)以副產(chǎn)物的形式產(chǎn)生這些活性氧，這些ROS幾乎會(huì)給細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的生物大分子（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA）造成損傷。因此，細(xì)菌進(jìn)化出了多種酶來(lái)清除這些ROS和修復(fù)由它們?cè)斐傻姆肿訐p傷，并通過(guò)可以感受這些活性氧的調(diào)控蛋白來(lái)調(diào)控這些酶

2、或相關(guān)基因的表達(dá)。在Escherichia coli中，主要有兩條應(yīng)答由活性氧而引起的氧化脅迫的通路，一條是由OxyR/S調(diào)控的應(yīng)答過(guò)氧化氫的途徑，另一條是由SoxR/S調(diào)控的應(yīng)答超氧化物的途徑。但是，在Shewanella oneidensis中我們通過(guò)序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)只有OxyREC的同源蛋白SO1328，而并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SoxR/S的同源蛋白。這說(shuō)明在S.oneidensis中的氧脅迫應(yīng)答可能與E.coli中有著明顯的差異，這也是我們

3、進(jìn)行本研究的前提。
　　通過(guò)序列和結(jié)構(gòu)對(duì)比我們發(fā)現(xiàn)SO1328和OxyR有著很大的相似性，它們都是LysR家族的調(diào)控蛋白，而且SO1328中也含有兩個(gè)在大部分OxyR蛋白中都保守的感受H2O2的半胱氨酸，因此我們將SO1328命名為OxyRso。
　　本文主要介紹我們對(duì)OxyRso在S.oneidensis面臨H2O2的過(guò)程中所發(fā)揮的作用以及其相應(yīng)的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析，我們確定了OxyRso確實(shí)是S.oneid

4、ensis中調(diào)控氧脅迫應(yīng)答H2O2的重要調(diào)控蛋白，katB，katG-1，ahpC，dps，ccpA這些可被H2O2誘導(dǎo)的基因都受到它的調(diào)控。
　　我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在沒(méi)有氧化脅迫的情況下（OxyRso處于還原態(tài)）OxyRso是阻遏katB和dps的表達(dá)，并且KatB是S.oneidensis中清除H2O2的主要過(guò)氧化氫酶，而在氧化脅迫的條件下(OxyRso處于氧化態(tài))時(shí)OxyRso是誘導(dǎo)以上所說(shuō)的五個(gè)基因的表達(dá)的。因此，OxyR

5、so的這種調(diào)控機(jī)制是和OxyREC不同的。另外，我們發(fā)現(xiàn)E.coli的OxyREC幾乎不能回補(bǔ)S.oneidensis的△oxyRso的表型，同樣S.oneidensis MR-1的OxyRso也無(wú)法回補(bǔ)E.coli的△oxyR表型。
　　表型分析我們發(fā)現(xiàn)△oxyRso在固體LB平板上的生長(zhǎng)明顯受到影響，△oxyRso無(wú)法形成單菌落而且存活率明顯下降。這種生長(zhǎng)缺陷可以通過(guò)在平板上添加外源的過(guò)氧化氫酶或者是FeSO4而得到很大程度的

6、恢復(fù)。我們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)△oxyRso的這種表型是由于其在低細(xì)胞濃度情況下無(wú)法清除平板上自發(fā)產(chǎn)生的H2O2和細(xì)胞內(nèi)鐵代謝受損引起的。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)在中敲除dps后其在LB平板上的存活率得到提高，這說(shuō)明細(xì)胞在被敲除oxyRso后有可能處于缺鐵狀態(tài)。
　　在S.oneidensis中只有一個(gè)超氧化物歧化酶基因sodB，我們通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的SodB的表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，至少我們實(shí)驗(yàn)中所用的產(chǎn)生超氧化物試劑甲基紫精(paraquat)對(duì)其誘導(dǎo)效

7、果不明顯，隨著PQ的濃度的增加sodB的啟動(dòng)子活性也有所增加，但是最大值都僅僅只是非誘導(dǎo)條件下的二倍，而且超氧化物歧化酶活性染色顯示，不同濃度PQ下SodB的活性基本保持不變。無(wú)論是sodB的表達(dá)量還是SodB的活性在△fur中都出現(xiàn)了下降，這說(shuō)明sodB的正常表達(dá)是需要Fur的。而fur是否和在E.coli中一樣受到OxyRso的調(diào)控我們目前還沒(méi)有得出明確的結(jié)論。但是，從啟動(dòng)子活性分析結(jié)果來(lái)看，在△oxyRso中fur的表達(dá)量有微弱的