泥鰍發(fā)育不同時期性腺轉(zhuǎn)錄組學研究及Wnt4基因的生物信息學分析.pdf

1、泥鰍屬于鯉形目，鰍科，花鰍亞科，泥鰍屬，廣泛分布于中國，日本，韓國，俄羅斯和印度等地。它被稱為“水中人參”，是一種高營養(yǎng)價值的魚。此外，泥鰍是中國經(jīng)濟重要的養(yǎng)殖魚類?？刂坪凸芾砟圉q的繁殖是在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)系統(tǒng)中獲得這種魚的可持續(xù)供應的必要步驟。因此，對該物種性腺發(fā)育和配子形成的分子調(diào)節(jié)機制的研究在水產(chǎn)養(yǎng)殖和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴利用石蠟切片對泥鰍性腺發(fā)育時期進行組織形態(tài)學觀察，從而確定泥鰍性腺的幾個關(guān)鍵

2、發(fā)育時期分別是原始生殖細胞(PGC)，Ⅱ期精巢(T2)，Ⅱ期卵巢(O2)，成熟精巢(TA)和成熟卵巢(OA)。⑵使用Illumina測序技術(shù)對以上性腺發(fā)育關(guān)鍵時期進行從頭轉(zhuǎn)錄組裝配和基因表達分析。Illumina測序共產(chǎn)生321050936個raw reads。在去除銜接子序列，不明確的核苷酸和低質(zhì)量序列后，仍有315776696個clean reads。與Nr，Nt，Swiss-Prot，KEGG，GO，KOG和Pfam七個數(shù)據(jù)庫進行

3、比對，至少與一個數(shù)據(jù)庫比對成功注釋的有68718個unigenes(48.15％)，與所有七個數(shù)據(jù)庫比對成功的有10813個unigenes(7.57％)。此外，為原始生殖細胞(PGC)，Ⅱ期精巢(T2)，Ⅱ期卵巢(O2)，成熟精巢(TA)和成熟卵巢(OA)構(gòu)建了5個數(shù)字基因表達庫(DGE)，還鑒定了五個樣品中許多基因的特異性表達。在5個文庫中選擇具有高差異表達的一些基因作為與性腺發(fā)育相關(guān)的候選物。⑶通過qRT-PCR與Illumina

4、測序數(shù)據(jù)文庫中的FPKM值相互驗證得到，qPCR表達結(jié)果與從Illumina測序數(shù)據(jù)文庫獲得的結(jié)果大部分的表達趨勢都是一樣的。這也證明測得的五個轉(zhuǎn)錄組文庫數(shù)據(jù)是可靠及準確的，可以為以后的實驗提供依據(jù)。⑷根據(jù)已經(jīng)得到的文庫數(shù)據(jù)進行搜索，并且參考其它硬骨魚類的Wnt4基因序列保守區(qū)設計引物，結(jié)合PCR克隆技術(shù)，得到了泥鰍該基因的全長序列。結(jié)果表明，其中5'非翻譯區(qū)（5'-UTR）429 bp，3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)包含polyA尾共1

5、092 bp，開放閱讀框1056bp，編碼351個氨基酸。用ProtParam分析分子量為39181道爾頓，理論等電點為8.68，共20種氨基酸，有22個氨基酸的信號肽序列，有跨膜區(qū)。對泥鰍WNT4蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測，發(fā)現(xiàn)α螺旋占比32.39％，β轉(zhuǎn)角占比8.24％，無規(guī)卷曲占比39.77％，延伸鏈占比19.6％。氨基酸序列與硬骨魚類中保守性較高，而與兩棲類、鳥類、哺乳類動物間保守性較低。泥鰍與同為鯉形目的模式生物斑馬魚的該基因間的