唐古特白刺N(yùn)tP5CS和NtCIPK2基因的克隆及功能分析.pdf

1、強(qiáng)旱生鹽生植物唐古特白刺（Ⅳitrariaria tangutorum Bobr.）為中國特有的多年生落葉灌木，具有極強(qiáng)的抗逆能力，沙埋后可通過克隆生長形成白刺包，是土壤荒漠化和鹽堿化防治的先鋒植物。然而，由于遺傳信息的缺乏，該植物抗逆分子機(jī)制的研究進(jìn)展十分緩慢。本研究從唐古特白刺中克隆脯氨酸合成途徑的關(guān)鍵基因二氫吡咯-5-羧酸合成酶NtP5CS和鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要組分鈣調(diào)磷酸酶B類似蛋白互作激酶NtCIPK2，分析兩基因的序列信息、系

2、統(tǒng)進(jìn)化、細(xì)胞定位、啟動子結(jié)構(gòu)及表達(dá)特性，探討其在大腸桿菌和擬南芥中抵抗非生物脅迫過程中發(fā)揮的作用，并進(jìn)行紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化和初步驗(yàn)證。本研究的開展對于深入了解唐古特白刺的抗逆分子機(jī)制，開發(fā)利用唐古特白刺抗逆資源及培育抗逆牧草新品種具有重要的意義。主要研究結(jié)果如下:
　　1.從唐古特白刺中分離獲得NtP5CS和NtCIPK2基因，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NtP5CS和NtCIPK2基因編碼蛋白具有與擬南芥、水稻等其他物種同源蛋白一致的典

3、型特征、關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域和活性調(diào)控位點(diǎn)，據(jù)此推測這兩個基因編碼蛋白與同源蛋白具有相似的功能，即在唐古特白刺Pro的合成及鈣信號傳導(dǎo)機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，NtP5CS主要分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞核中，而NtCIPK2在整個細(xì)胞中廣泛存在。
　　2.利用SiteFinding-PCR技術(shù)獲得NtP5CS和NtCIPK2基因的啟動子序列，長度分別為2566 bp和1612 bp。通過啟動子預(yù)測軟件分析，發(fā)現(xiàn)兩個基因的啟動子中含

4、有大量逆境脅迫響應(yīng)元件，如W-box、MYB、MYC、HSE和LTRE元件等，這些逆境響應(yīng)元件的存在，表明NtP5CS和NtCIPK2基因的表達(dá)可能受到干旱、高鹽、高溫和低溫等非生物脅迫因素的誘導(dǎo);半定量RT-PCR結(jié)果證實(shí)，在干旱、高鹽、高溫及低溫4種脅迫條件下，兩個基因表達(dá)量明顯升高，在唐古特白刺生境適應(yīng)過程中發(fā)揮積極作用。
　　3.構(gòu)建NtP5CS和NtCIPK2基因的原核表達(dá)載體，并進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，模擬鹽、堿、干旱、

5、滲透、高溫和低溫6種脅迫條件，發(fā)現(xiàn)重組菌株的生長狀況明顯優(yōu)于對照菌株，兩個基因的表達(dá)均可顯著提高大腸桿菌的多重抗逆能力;以唐古特白刺和擬南芥作為抗逆和非抗逆植物的代表，比較分析NtP5CS與AtP5CS基因的表達(dá)對大腸桿菌的影響。結(jié)果表明，NtP5CS相較AtP5CS而言，可以更有效的提高大腸桿菌對于6種脅迫的抗性，證明基因來源的不同可能導(dǎo)致植物抗逆能力的差異。
　　4.將NtP5CS和NtCIPK2基因在擬南芥中過量表達(dá)，在模擬

6、鹽和干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)率、根長和生長狀況等表型特征均優(yōu)于野生型植株，轉(zhuǎn)基因擬南芥可溶性糖和脯氨酸的含量顯著高于野生型植株，丙二醛MDA上升幅度和葉綠素下降幅度顯著低于野生型植株，說明NtP5CS和NtCIPK2基因的表達(dá)從積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，減緩膜脂過氧化反應(yīng)，增強(qiáng)光合作用等方面提高了擬南芥的抗旱性和耐鹽性。
　　5.以下胚軸作為外植體材料，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將NtP5CS和NtCIPK2基因轉(zhuǎn)化紫花苜?！爸熊僖惶枴?/p>