新型納米催化劑的設(shè)計(jì)及用于特定細(xì)胞與細(xì)胞中重要小分子的檢測(cè).pdf_第1頁
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1、細(xì)胞是生物體形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的基本單元。在細(xì)胞中存在著一些具有特殊生理功能的活性小分子物質(zhì),如H2O2、 O2等;它們?cè)诩?xì)胞生物過程中的作用與其在細(xì)胞內(nèi)的含量密切相關(guān)。如當(dāng)細(xì)胞中H2O2濃度較低時(shí),它參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、多種因子細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的啟動(dòng),并且控制細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等;而當(dāng)其高濃度較高時(shí),則會(huì)引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和酶的變性、DNA的損傷等,進(jìn)而造成細(xì)胞的死亡、機(jī)體的炎癥、甚至心血管疾病、神經(jīng)元退變及腫瘤疾病的

2、發(fā)生。因此,對(duì)細(xì)胞內(nèi)一些重要活性小分子進(jìn)行實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的檢測(cè)不僅能幫助我們從分子水平理解它們介導(dǎo)生理過程的機(jī)制,而且能夠有助于揭示這些活性小分子與人類相關(guān)疾病之間的內(nèi)在規(guī)律。電化學(xué)方法具有響應(yīng)快、專一性強(qiáng)和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),成為細(xì)胞中一些活性小分子檢測(cè)的常用技術(shù)手段,該方法不僅能夠準(zhǔn)確測(cè)量細(xì)胞中活性小分子的含量,更能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活性小分子從細(xì)胞中向胞外釋放的動(dòng)力學(xué)過程。而掌握納米材料的電催化特性,尤其是理解檢測(cè)對(duì)象在納米電催化劑表面氧化還原反應(yīng)

3、的機(jī)制,從而選擇合適的納米材料構(gòu)建具有高電催化活性的表界面,能夠極大程度提高電化學(xué)檢測(cè)方法的靈敏度與專一性。
  本論文制備了一系列納米電催化劑,研究了細(xì)胞中H2O2含量的電化學(xué)檢測(cè)方法、細(xì)胞中H2O2的釋放過程動(dòng)力學(xué)以及細(xì)胞中H2O2的胞吐過程等;本論文還用密度泛函理論(DFT)闡明了H2O2和O2分子在納米電催化劑(如氮摻雜石墨烯及石墨炔等)表面的電催化還原反應(yīng)的機(jī)制。本論文的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
  1.制備了辣根過氧

4、化物酶-凹土(HRP-Atta)納米復(fù)合催化劑并將其應(yīng)用于巨噬細(xì)胞RAW264.7中H2O2含量的電化學(xué)檢測(cè)。利用物理吸附法將HRP固定到凹土表面制備得到HRP-Atta納米復(fù)合催化劑,用透射電鏡(TEM)、原子力顯微鏡(AFM)、紅外光譜(FTIR)、紫外-可見光譜(UV-vis)、圓二色光譜(CD)等對(duì)其進(jìn)行了表征,研究結(jié)果表明,HRP分子能夠通過靜電作用成功吸附在凹土表面并能很好地維持其天然的空間結(jié)構(gòu)。電化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HRP分

5、子在凹土表面能夠進(jìn)行有效的直接電子轉(zhuǎn)移反應(yīng),其伏安曲線上呈現(xiàn)出一對(duì)良好的氧化還原峰,氧化峰電位(Epa)和還原峰電位(Epc)分別為-295和-360 mV(vs.SCE,100 mV/s);進(jìn)一步的研究結(jié)果表明,HRP-Atta納米復(fù)合催化劑對(duì)H2O2的電化學(xué)還原反應(yīng)具有良好的催化性能,對(duì)H2O2的定量測(cè)定具有響應(yīng)速率快(2 s)、線性范圍寬(0.2-150μmol/L)、靈敏度高(55.8±2.9μA L/mmol cm2)及檢測(cè)限

6、低(0.05±0.01μmol/L)等優(yōu)點(diǎn)。將HRP-Atta復(fù)合催化劑應(yīng)用于RAW264.7細(xì)胞中H2O2含量的電化學(xué)檢測(cè),結(jié)果表明該復(fù)合物可以準(zhǔn)確地測(cè)定細(xì)胞中H2O2的含量為(0.29±0.05)mmol/L,并且不受細(xì)胞內(nèi)其他活性氧物質(zhì)(ROS)和電活性物質(zhì)如OCl-和抗壞血酸等的干擾。
  2.建立了一種制備氮摻雜石墨烯(N-graphene)的簡(jiǎn)單方法。該方法以水合肼為還原劑,在水熱條件下一步實(shí)現(xiàn)氧化石墨烯的還原及氮原子

7、的摻雜從而制備得到N-graphene。利用TEM、AFM、FTIR、拉曼光譜(Raman)和X-射線光電子能譜(XPS)等對(duì)制備的N-graphene進(jìn)行了表征。結(jié)果表明,所得到的N-graphene具有單層結(jié)構(gòu),N元素含量為4.5%,其中吡啶型N、吡咯型N、石墨型N及氧化吡啶型N分別為28%、49%、19%及4%。循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明N-graphene對(duì)H2O2電化學(xué)還原具有高的催化活性,還原起峰電位分別比不摻雜的石墨烯及玻碳正移

8、了230和280mV,還原電流密度也分別比不摻雜的石墨烯及玻碳提高到2倍和25倍。將N-graphene應(yīng)用于活細(xì)胞如嗜中性粒細(xì)胞、RAW264.7細(xì)胞及人乳腺癌細(xì)胞MCF-7中H2O2的電化學(xué)監(jiān)測(cè),結(jié)果表明N-graphene具有良好的生物相容性及高的穩(wěn)定性,能用于細(xì)胞中H2O2釋放動(dòng)力學(xué)及不同外界刺激條件下細(xì)胞胞吐過程的研究。
  3.利用DFT方法研究了N-graphene中N摻雜微觀構(gòu)型對(duì)H2O2電還原反應(yīng)催化活性的影響。

9、分別研究了H2O2在石墨烯、吡啶型N-graphene、吡咯型N-graphene及石墨型N-graphene表面的吸附以及電催化還原過程的機(jī)制。結(jié)果表明;H2O2在石墨烯及N-graphene表面的吸附過程屬于弱的物理吸附,而當(dāng)反應(yīng)體系中引入質(zhì)子和電子后,一系列化學(xué)反應(yīng)隨之發(fā)生,包括H2O2分子中的O-O鍵的斷裂、-OH的生成、-OH以C-O鍵的形式在石墨烯及N-graphene表面的化學(xué)吸附及兩個(gè)H2O分子的生成。對(duì)H2O2還原的反

10、應(yīng)能及還原反應(yīng)每個(gè)步驟的可逆電勢(shì)進(jìn)行了計(jì)算;結(jié)果表明,H2O2在石墨烯及N-graphene表面的電還原反應(yīng)為自發(fā)的反應(yīng)過程,并且石墨烯納米催化劑對(duì)H2O2還原反應(yīng)的電催化活性順序?yàn)檫拎ば蚇-graphene>吡咯型N-graphene>石墨型N-graphene>石墨烯。我們還從靜電勢(shì)及最高占有軌道(HOMO)與最低空未占軌道(LUMO)之間能級(jí)差的角度就N摻雜構(gòu)型對(duì)H2O2電還原反應(yīng)催化活性的影響規(guī)律進(jìn)行了解釋。
  4.采用

11、DFT方法研究了新型二維碳材料石墨炔表面的氧氣電催化還原反應(yīng)(ORR)的機(jī)制。我們首先對(duì)石墨炔的構(gòu)型進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)其表面的電荷分布進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)石墨炔結(jié)構(gòu)中的碳原子分別以sp-及sp2-雜化狀態(tài)的C≡C及C=C鍵模式存在,其表面電荷分布明顯不均勻,存在大量的帶有正電荷的碳原子,能夠?yàn)镺2及OOH+分子的吸附及催化反應(yīng)提供多個(gè)位點(diǎn)。我們還對(duì)石墨炔表面的ORR反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了研究;結(jié)果表明,O2及OOH+分子在石墨炔表面通過C-O化學(xué)鍵形

12、成了有效的化學(xué)吸附,吸附能分別為-1.48 eV和-4.28 eV,并且在石墨炔表面發(fā)生了O-O鍵的斷裂從而實(shí)現(xiàn)了4電子的還原反應(yīng);我們通過反應(yīng)能及可逆電勢(shì)的計(jì)算證明了石墨炔表面的ORR反應(yīng)屬于自發(fā)的放熱反應(yīng),說明石墨炔對(duì)ORR反應(yīng)具有高的電催化活性,并從HOMO-LUMO之間能級(jí)差的角度對(duì)石墨炔具備的高催化活性進(jìn)行了解釋。
  5.制備了適配體-Ag-Au納米復(fù)合物(aptamer-Ag-Au),并將其應(yīng)用于人乳腺癌細(xì)胞的拉曼(

13、Raman)檢測(cè)及近紅外光療。用光還原法以核酸適配體S2.2為模板合成了aptamer-Ag-Au納米復(fù)合物,并用UV-vis及TEM對(duì)其進(jìn)行了表征。相差(DIC)、熒光、Raman光譜及TEM結(jié)果表明,制備的納米復(fù)合物可以通過S2.2和MCF-7細(xì)胞膜表面的粘蛋白MUC1之間的特異性作用結(jié)合在MCF-7細(xì)胞表面,從而特異性地識(shí)別MCF-7細(xì)胞,而該復(fù)合物與其他類型的腫瘤細(xì)胞(如人肝癌細(xì)胞HepG2)或正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A等不

14、能發(fā)生特異性結(jié)合。制備的aptamer-Ag-Au復(fù)合物還具有高的表面增強(qiáng)拉曼(SRER)活性,其Raman增強(qiáng)因子能夠達(dá)到106,因此可以應(yīng)用于MCF-7細(xì)胞的高靈敏及高特異性Raman檢測(cè)。進(jìn)一步將所制備的aptamer-Ag-Au應(yīng)用于MCF-7細(xì)胞的光熱治療,研究結(jié)果表明,aptamer-Ag-Au復(fù)合物能吸收近紅外光并將光能轉(zhuǎn)化為熱能傳遞給靶細(xì)胞MCF-7,在功率0.25 W/cm2的近紅外光光照1h能有效地將MCF-7細(xì)胞的

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