簡(jiǎn)介：內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文皮膚光老化的分子生物學(xué)機(jī)制及其防護(hù)治療研究姓名張國惠申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)免疫學(xué)指導(dǎo)教師博曉真20070501中文摘要目的通過研究皮膚光老化的機(jī)制，進(jìn)而探討第三代維甲酸他扎羅汀對(duì)皮膚光老化的預(yù)防及臨床治療作用。方法應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)MMPL、CJM及ICAM1光老化皮膚在治療前后的不同表達(dá)及不同年齡組中治療前后的表達(dá)水平；結(jié)果1光老化皮膚中，仇口一L、CJM及ICAM1在治療前后的表達(dá)有顯著性差異PO05；2不同年齡組中H心伊一L、CJM及ICAM一1在治療前的表達(dá)有顯著性差異P005；在治療后的表達(dá)也有顯著性差異PO05，但較治療前的差異減小。3岱伊一1與CJ吼在光老化皮膚中的表達(dá)呈正相關(guān)PO01，MMP一1與ICAM一1的表達(dá)也呈正相關(guān)P0OR。結(jié)論1他扎羅汀是第三代維甲酸新藥，可能通過調(diào)控光老化皮膚中MMPL、CJ吼及ICAM一1的表達(dá)而抑制膠原的減少。2在光老化皮膚中MMP一1不僅與CJM的表達(dá)密切相關(guān)，也與ICAML的表達(dá)密切相關(guān)。3他扎羅汀通過抑制膠原的減少，可延緩和治療皮膚光老化。關(guān)鍵詞N伊一1CJMICAM1皮膚光老化他扎羅汀

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多THAP11與PCBP1相互作用的分子機(jī)制及其生物學(xué)功能研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多葡萄球菌腸毒素B的分子修飾及其生物學(xué)活性研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文從系統(tǒng)生物學(xué)水平研究白血病治療的分子機(jī)制姓名王侃侃申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博士專業(yè)遺傳學(xué)指導(dǎo)教師陳竺20050501上海第二醫(yī)辯大學(xué)璃士論文從系統(tǒng)生物學(xué)水平研究自盤病治療的分子視制中文攘羹研究重大疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療等復(fù)雜過程需要以科學(xué)假說為懿提，從蛙闋、空闋黔恁發(fā)，逶過離遙攮的手段對(duì)瘸交組織釋緇胞豹鼙西及蘊(yùn)商進(jìn)行大規(guī)模的定量檢測(cè)，從褥達(dá)到了鰓生甥學(xué)信息在該過程中的運(yùn)佧規(guī)籜。急滋舉翁粒緇藏性囪斑瘸APL是應(yīng)用誘導(dǎo)分化／凋亡治療人類腫瘤的成功范例，維甲酸RA與三氯化二砷ATO的聯(lián)合熙騖可默使大多數(shù)病人獲得離質(zhì)量的筏時(shí)闖無瘸生存期。為了揭示這一高效治療的復(fù)雜機(jī)捌，我們J敷用系鏡生甥學(xué)妁理念和方法，遺過整合基因芯片、二維凝蔽毫泳及矮譜分轎等手段，對(duì)APL細(xì)胞棟NB4分剮瘸ILA、ATO及RA／ATO進(jìn)行處理，并牧集不秘對(duì)瀚段黥樣本，靖基灝幫蛋自豹表達(dá)大蕊摸魂避行動(dòng)態(tài)性的寇豢分析。高通贛、多層顢?shù)亩嘌芯慨a(chǎn)生海量的生物學(xué)數(shù)握，為了準(zhǔn)確無談逸黲輯這些數(shù)據(jù)中掰蕊藏的矍耪學(xué)信患及其遙律麓棒，我稍痘璃了CPPSOMCOMPONENTPLANEPRESENTATIONINTEGRATEDSELFORGANIZINGⅨAP、多項(xiàng)式曲線瓠合及多重假設(shè)稔驗(yàn)、基閡／諼自功能富集分析、自然語言文本挖援及功麓鼴終鶼建立等詩算鴦甥學(xué)辯生懿信患學(xué)方法。崧茂基磴上，我們發(fā)現(xiàn)了一系列與粒系分化及凋亡相關(guān)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的鞭特點(diǎn)，包撼轉(zhuǎn)蒙慰子及轆助轉(zhuǎn)淥豳子、鈣倦號(hào)遙路、干擾豢遴潞、泛素～簧囪酶體系統(tǒng)韻激滔，PMLRAR氈器自的隧解秘駭髂NUCLEARBODY熟莛建，纓腿鼴麓黻滯及凋亡潛能的羹新獲得等。簡(jiǎn)對(duì)，對(duì)予受RA調(diào)變酌基閑，我們還對(duì)其上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列邀露轉(zhuǎn)滎囂予縫合廖列豹頻棗拱撼、權(quán)鬟艇陣秘概率模型分拼簿數(shù)理統(tǒng)計(jì)的處理，發(fā)現(xiàn)包括RARE維甲酸反應(yīng)元件在內(nèi)的一些特定轉(zhuǎn)淥趿子的縫合序列在這些LA壤變的基因中存在著蜜集分布的現(xiàn)象，觚兩在基掰組水平對(duì)轉(zhuǎn)錄組放蛋盤質(zhì)綴懿信惑避行了霄力的羚充。我們遂黢察到不嗣蓊臻濃度翡淞辯敉系分純相關(guān)拘轉(zhuǎn)蒙因子的激活及粒系特征

簡(jiǎn)介：該研究是為了觀察后縱韌帶骨化患者非骨化部位的脊柱韌帶在體外培養(yǎng)條件下的形態(tài)學(xué)特征、成骨能力BMP2及TNFΑ在后縱韌帶組織中的表達(dá)情況骨形態(tài)發(fā)生蛋白2與腫瘤壞死因子Α及兩者協(xié)同作用在后縱韌帶成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下的細(xì)胞增殖、膠原合成、ALP活性及骨鈣素分泌水平的影響同時(shí)探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白2與腫瘤壞死因子Α聯(lián)合誘導(dǎo)脊柱韌帶成纖維細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞表型中核結(jié)合因子CBFAL表達(dá)的可能性、SMAD1與SMAD5在其中的信號(hào)傳導(dǎo)作用及分子機(jī)制結(jié)論①后縱韌帶骨化患者脊柱韌帶細(xì)胞體外培養(yǎng)可表達(dá)成骨細(xì)胞表型后縱韌帶骨化患者的某些成骨因子可能分泌異常②TNFΑ與BMP2聯(lián)合作用可誘導(dǎo)脊柱韌帶成纖維細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞表型BMP2與TNFΑ在OPLL的發(fā)生中可能起著重要作用③TNFΑ的刺激可能為BMP2提供了與其結(jié)合的受體它還可能通過RAS激活的ERK途徑誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞相關(guān)基因④TNFΑ與BMP2在誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞表型中起著協(xié)同作用

簡(jiǎn)介：生物醫(yī)用材料是材料科學(xué)技術(shù)的一個(gè)分支，相關(guān)研究涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最基本的科學(xué)問題。為了探討無生命的物質(zhì)參與構(gòu)建有生命組織的機(jī)制，開展了鈣磷降解材料生物礦化的細(xì)胞分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究。設(shè)計(jì)并建立了細(xì)胞培養(yǎng)→基因克隆→基因表達(dá)→蛋白質(zhì)純化→蛋白質(zhì)分子與材料作用的系統(tǒng)研究模式。首先采用酶消化法和植塊法從WISTAR乳鼠顱骨體外分離培養(yǎng)了大鼠成骨細(xì)胞，兩種方法獲得的成骨細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)和純化后，顯示出高的堿性磷酸酶活性和鈣結(jié)節(jié)形成能力，具有良好的生物學(xué)特性。將原代培養(yǎng)后傳至第3代、經(jīng)過純化、狀態(tài)良好的成骨細(xì)胞進(jìn)行凍存，復(fù)蘇后存活率達(dá)93％，堿性磷酸酶染色呈強(qiáng)陽性，有鈣結(jié)節(jié)形成，可擴(kuò)增堿性磷酸酶基因，與未凍存細(xì)胞比較，復(fù)蘇細(xì)胞的生物學(xué)特性無明顯改變；設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR反應(yīng)特異性引物F1、R1，從酶消化法分離培養(yǎng)的WISTAR乳鼠成骨細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出骨粘連蛋白的編碼區(qū)CDNA序列，將PCR產(chǎn)物插入PBST載體，測(cè)序并與GENBANK核酸數(shù)據(jù)庫比對(duì)，其序列與GENBANK核酸數(shù)據(jù)庫中收錄的一致；將大鼠骨粘連蛋白基因重組到原核表達(dá)載體PGEXKG中，構(gòu)建了正確的表達(dá)載體PGEXKGON，在大腸桿菌ECOLIBL21DE3PLYSS中實(shí)現(xiàn)了全長表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白存在于細(xì)菌裂解液上清中，上清中的目的蛋白采用硫酸銨分級(jí)沉淀、超濾膜分離、GST親和層析逐步純化，獲得了高純度的大鼠骨粘連蛋白；將大鼠成骨細(xì)胞與鈣磷材料混合培養(yǎng)，顯微鏡下可觀察到成骨細(xì)胞對(duì)鈣磷材料有明顯的吞噬作用；細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT和CKK8等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鈣磷材料有利于成骨細(xì)胞增殖；將骨粘連蛋白與CA2離子作用，采用等離子體發(fā)射光譜儀進(jìn)行檢測(cè)，證明所獲得的骨粘連蛋白可結(jié)合鈣離子；骨粘連蛋白與鈣磷材料作用后，SEM、XRD、XPS測(cè)試結(jié)果顯示，蛋白在鈣磷材料表面發(fā)生了吸附和鍵合反應(yīng)。骨粘連蛋白通過CA2離子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合CA2，通過NH3結(jié)合PO43，并啟動(dòng)羥基磷灰石晶核形成，以高的親和力吸附羥基磷灰石晶核后，從材料表面解吸，通過膠原結(jié)合位點(diǎn)在膠原纖維上吸附，實(shí)現(xiàn)其結(jié)合鈣磷、轉(zhuǎn)運(yùn)鈣磷、結(jié)合膠原蛋白的功能，引導(dǎo)鈣鹽在基質(zhì)中沉積和骨的礦化。

簡(jiǎn)介：中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文RNA干涉RPS12基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響及分子機(jī)制探討姓名閆楊申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)遺傳學(xué)指導(dǎo)教師孫秀菊20070401中文論著摘要RNA干涉RPSL2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響及分子機(jī)制探討摘要胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的健康。多種癌基因和抑癌基因的異常與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但是目前關(guān)于對(duì)胃癌防治具有重要意義的靶基因報(bào)道很少。因此，研究與胃癌密切相關(guān)的基因十分必要。為此本課題組前期應(yīng)用抑制消減雜交SSH篩查發(fā)現(xiàn)一些在胃癌中差異表達(dá)的基因，進(jìn)一步應(yīng)用基因芯片、斑點(diǎn)雜交等技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因在異型增生、早期胃癌、進(jìn)展期胃癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌以及癌旁組織中的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了這些基因在胃癌發(fā)生發(fā)展不同階段的差異表達(dá)情況。核糖體蛋白12RIBOSOMALPROTEINS12，脬酣2基因是其中之一。該基因在胃癌發(fā)生發(fā)展不同階段病變的標(biāo)本中表達(dá)增高，是胃癌發(fā)生、發(fā)展不同階段的重要差異表達(dá)基因。但是該基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用究竟如何，有待通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。在前期工作的基礎(chǔ)上，為深入研究RPSL2基因在胃癌中的作用，本課題擬構(gòu)建RPSL2基因SHRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞并證實(shí)對(duì)RPSL2基因的抑制作用后，觀察對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性如細(xì)胞凋亡、增殖的影響，并探討其分子機(jī)制。本研究將加深對(duì)胃癌分子機(jī)制的理解，并有望發(fā)現(xiàn)胃癌診治、預(yù)后判定的新標(biāo)志。材料及方法1．實(shí)驗(yàn)材料胃癌細(xì)胞系BGC823、RPMLL640培養(yǎng)基、TRIZOLREAGENT、TAQDNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒QIAGEN；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒INVITROGEN，BAMHI、HINDIII、ECORI核酸內(nèi)切酶TAKARA；PI、JML09感受

簡(jiǎn)介：新近研究證實(shí)一類新型的間質(zhì)細(xì)胞存在，其特征是伴有長（數(shù)十至數(shù)千微米不等）而纖細(xì)（直徑寬約0105微米）的突起。該群細(xì)胞被命名為TELOCYTES，其突起命名為TELOPODES。迄今，在包括心臟在內(nèi)的哺乳動(dòng)物多臟器中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TELOCYTES的空間分布。通過TELOPODES，TELOCYTES能夠與其他類別的心臟原位細(xì)胞，毛細(xì)血管或者神經(jīng)末梢相互作用。并且，他們一同組成一個(gè)間質(zhì)系統(tǒng)，能夠起作用于心臟更新，再生以及修復(fù)。雖然一些與協(xié)調(diào)相關(guān)的功能在當(dāng)前已有所研究，例如對(duì)心外膜干細(xì)胞池中的心肌祖細(xì)胞的調(diào)控以及在心肌梗死病理下血管新生，然而，涉及這些機(jī)制的系統(tǒng)化研究需要從心臟組織中純化此類細(xì)胞。在TELOCYTES特有的細(xì)胞形態(tài)之外，其分子生物標(biāo)記也已有所明確。相應(yīng)于此，我們運(yùn)用流式細(xì)胞儀，以其細(xì)胞膜表面CD34和CD117為分子靶向，成功的分離出心臟TELOCYTES?；诩兓?xì)胞的基礎(chǔ)上，此后相繼開展了電生理、生物化學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從而進(jìn)一步揭示此類細(xì)胞的基本特性。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了心臟TELOCYTES能夠通過旁分泌方式和促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞自分泌血管內(nèi)皮生長因子方式來加快微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。上述發(fā)現(xiàn)必將為理解局部血管新生及心臟生理和防護(hù)提供新的理念。第一部分心臟TELOCYTES分離、培養(yǎng)、純化、鑒定及培養(yǎng)基優(yōu)化目的純化心臟TELOCYTES并優(yōu)化其培養(yǎng)基。方法利用6周齡的C57BL6J小鼠，消化法分離心臟原位細(xì)胞，依據(jù)細(xì)胞間貼壁時(shí)間的差異，初步篩選并培養(yǎng)原代心臟TELOCYTES，借助流式細(xì)胞儀純化原代中CD34CD117表達(dá)細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡掃描VIMENTIN表達(dá)及普通顯微鏡觀察TELOCYTES特征形態(tài)。通過CCK8對(duì)TELOCYTES在4種不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基低糖DMEM伴10％胎牛血清、低糖DMEM伴20％胎牛血清、高糖DMEM伴10％胎牛血清、高糖DMEM伴20％胎牛血清，中增殖活力進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化適合TELOCYTES生長環(huán)境。結(jié)果原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀分析CD34CD117240％CD34CD11774％，CD34CD11746％，CD34CD11764％。CD34CD117表達(dá)細(xì)胞在普通顯微鏡下觀察其特異形態(tài)結(jié)構(gòu)細(xì)而長的細(xì)胞突起伴不規(guī)則串珠樣膨起，這符合TELOCYTES的特征性的結(jié)構(gòu)TELOPODESCD34CD117表達(dá)細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下可見骨架蛋白VIMENTIN在胞體和細(xì)胞突起的陽性表達(dá)，這符合TELOCYTESCD34CD117VIMENTIN的特異性表達(dá)。在4種不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)高糖DMEM伴10％胎牛血清同低糖DMEM伴10％胎牛血清、低糖DMEM伴20％胎牛血清及高糖DMEM伴20％胎牛血清相比較，在1H至4HTELOCYTES的細(xì)胞增殖活力明顯升高。結(jié)論在原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上采用CD34CD117表達(dá)分選的細(xì)胞具備TELOCYTES特征性結(jié)構(gòu)和蛋白表達(dá)，高糖DMEM伴10％胎牛血清為最優(yōu)TELOCYTES的培養(yǎng)基。第二部分心臟TELOCYTES增殖、TELOPODES演變及端粒酶活性分析目的時(shí)序性觀察TELOCYTES的增殖過程及TELOPODES的生長進(jìn)程。方法利用6周齡的C57BL6J小鼠，在心臟原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上采用流式細(xì)胞儀分選CD34CD117表達(dá)的TELOCYTES細(xì)胞，將其種植于6孔板中，借助CELLIQRIMAGINGPLATFM定時(shí)（20分鐘）連續(xù)（96小時(shí)）拍攝TELOCYTES分裂增殖的全部過程以及在TELOCYTES生長進(jìn)程中細(xì)胞突起TELOPODES的演變選取與心臟TELOCYTES同量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞以及心肌細(xì)胞，通過實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定各組端粒酶濃度的差異。結(jié)果在活細(xì)胞成像平臺(tái)下，貼壁的TELOCYTES在12H開始進(jìn)入界面構(gòu)象，48H出現(xiàn)雙核及胞體內(nèi)陷的縱向分裂征象，56H可見特征性的TELOPODES伴隨著子細(xì)胞向相反的方向移動(dòng)而逐漸成形。在TELOCYTES貼壁后的16H24H，細(xì)胞特征性突起TELOPODES在伴隨細(xì)胞生長進(jìn)程中不斷出現(xiàn)脫落和新生，脫落的TELOPODES分散成PODOMS和PODOMERS，布滿在TELOCYTES周圍空間。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞，心臟TELOCYTES以及心肌細(xì)胞中端粒酶檢測(cè)濃度分別為00668，01637，00974以及00006AMOLESUL。結(jié)論縱向分裂的TELOCYTES傳代時(shí)程較長，端粒酶活性相對(duì)較低，細(xì)胞生長過程可見TELOPODES新生與脫落交替出現(xiàn)，并以PODOMS和PODOMERS形式存在周圍空間。第三部分心臟TELOCYTES電生理特性及蛋白質(zhì)組學(xué)意義目的分析TELOCYTES的電生理特性及全細(xì)胞比較蛋白組學(xué)功能趨向。方法利用6周齡的C57BL6J小鼠，在心臟原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上采用流式細(xì)胞儀分選CD34CD117表達(dá)的TELOCYTES細(xì)胞，將其種植于GLASSBOTTOMDISH，運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡掃描NA，K，CA2離子通道在細(xì)胞膜表達(dá)將其種植于圓形載玻片上，在細(xì)胞外液140MMOLLNACL，5MMOLLKCL，2MMOLLCACL22MMOLLMGCL210MMOLLHEPES12MMOLLGLUCOSE2MMOLLCOCL22MMOLL4AP，2MMOLLBACL2，PH74，以15MLMIN的流速細(xì)胞內(nèi)液130MMOLLKASPARTATE6MMOLLNACL10MMOLLHEPES2MMOLLMGCL214MMOLLEGTA，2MMOLLCACL2，5MMOLLNA2ATP，PH74的環(huán)境下，保持電位為40MV，自110MV至10MV，以階差為20MV，運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)TELOCYTES的基本電生理特性。提取心臟TELOCYTES全細(xì)胞蛋白，運(yùn)用同位素標(biāo)簽相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)，質(zhì)譜分析肽段并鑒定蛋白組分，同時(shí)，與心臟干細(xì)胞、心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞及心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞之間蛋白定量比較，分析心臟TELOCYTES全細(xì)胞蛋白相對(duì)功能趨向。結(jié)果激光共聚焦顯微鏡掃描心臟TELOCYTES可見胞體及細(xì)胞突起膜表面NA，K，CA2離子通道分布表達(dá)運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)將CA2染色指示劑FURA2注入胞體觀察到TELOCYTES特征性形態(tài)以及胞體強(qiáng)表達(dá)和PODOMERS、PODOMS弱表達(dá)刺穿細(xì)胞膜后檢測(cè)TELOCYTES平均電容和平均電阻分別為2253PF和1565GΩ自110MV至10MV誘發(fā)TELOCYTES，未見動(dòng)作電位出現(xiàn)。心臟TELOCYTES與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞、心臟干細(xì)胞及心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞全細(xì)胞比較蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)分別存在16，32及90個(gè)差異表達(dá)蛋白，TELOCYTES分別上調(diào)表達(dá)細(xì)胞成分的形態(tài)發(fā)生K2C7，CTRO，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸SNAG，F(xiàn)LOT2，GBLP，和代謝過程GLO2，VPS4B核MRNA剪接SFRS5，代謝過程N(yùn)OL5AIDH3A，免疫系統(tǒng)的過程SAA3和運(yùn)輸FABP4細(xì)胞運(yùn)動(dòng)MYH9，ODFP2，細(xì)胞成分的形態(tài)發(fā)生MYH9，LMNA，SPTA2，K1CL3，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸RAB31，CHMP3，ARF3，NIPS1，細(xì)胞內(nèi)氨基酸的生物合成和代謝過程AL4AL，SCLYAATM，MMSA，CLTC，GLSL，PROD2，免疫系統(tǒng)的過程SODM，CATASBP1MOSC2GSTM1PRDX6THTRDNJA3BPHLPPIAEST31GST01，蛋白合成與代謝過程TCPQ，CH10，TCPB，UK114，CALR，TCPZ，TCPG，呼吸鏈電子傳遞和三羧酸循環(huán)QCR1，ETFD，MDHC，ODO1，SUCB2，CP2CT。結(jié)論心臟TELOCYTES膜表面存在NA，K，CA2離子通道，但沒有動(dòng)作電位發(fā)生，細(xì)胞間不以電信號(hào)傳遞差異蛋白組學(xué)提示心臟TELOCYTES在細(xì)胞成分的形態(tài)發(fā)生等方面高表達(dá)。第四部分心臟TELOCYTES空間分布及其對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響目的觀察心臟TELOCYTES與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞空間毗鄰位置關(guān)系以及對(duì)其增殖的影響。方法將6周齡的C57BL6J小鼠心臟，分離成1MM3大小，經(jīng)4％戊二醛PH73在4℃固定4H，后經(jīng)沖洗、梯度脫水、浸潤、包埋，加工超薄切片70NM，鋪FMVARCOATED銅網(wǎng)，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察心臟TELOCYTES形態(tài)及與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞空間毗鄰位置關(guān)系。分離心臟TELOCYTES與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞，運(yùn)用TRANSWELL技術(shù)將兩者共培養(yǎng)72H，采用碘化吡啶染色心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞核，借助流式細(xì)胞儀分析共培養(yǎng)組及對(duì)照組心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間細(xì)胞周期的差異。結(jié)果透射電鏡下，心臟TELOCYTES位于心臟間質(zhì)，心肌束之間，特征性結(jié)構(gòu)TELOPODES圍繞在微血管周圍，與微血管內(nèi)皮細(xì)胞毗鄰。TRANSWELL技術(shù)共培養(yǎng)心臟TELOCYTES與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組SG2M期153％117％，對(duì)照組SG2M期118％556％。結(jié)論心臟TELOCYTES與心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在重要的毗鄰空間位置關(guān)系，且心臟TELOCYTES旁分泌明顯促進(jìn)心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。第五部分心臟TELOCYTES旁分泌及其促微血管內(nèi)皮細(xì)胞自分泌研究目的分析心臟TELOCYTES旁分泌細(xì)胞因子、生物功能，及其對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞自分泌血管內(nèi)皮生長因子的影響。方法利用6周齡的C57BL6J小鼠，在心臟原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上采用流式細(xì)胞儀分選CD34CD117表達(dá)的TELOCYTES細(xì)胞，將其種植于6孔板中，貼壁后，無血清連續(xù)培養(yǎng)48H，分別在0，6，12，24和48H取上清液，運(yùn)用細(xì)胞因子抗體芯片技術(shù)，定量檢測(cè)120種細(xì)胞因子，選取48H時(shí)終濃度大于100PGML的細(xì)胞因子，并分析其參與機(jī)體生物功能。運(yùn)用TRANSWELL技術(shù)將心臟TELOCYTES和微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)72H后，分別在2，6，12，24，48及72H收集微血管內(nèi)皮細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)技術(shù)定量檢測(cè)血管內(nèi)皮生長因子含量。結(jié)果在48小時(shí)選取終點(diǎn)，36種細(xì)胞因子濃度大于100PGML，主要涉及免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間通信、化學(xué)因子、細(xì)胞粘附、凋亡、細(xì)胞增殖、生長發(fā)育及細(xì)胞表面受體相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，其中，13分泌因子與細(xì)胞生長相關(guān)。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)組較對(duì)照組，在48H和72H時(shí)，微血管內(nèi)皮細(xì)胞自分泌血管內(nèi)皮生長因子明顯增高。結(jié)論心臟TELOCYTES分泌細(xì)胞因子參與多種反應(yīng)，細(xì)胞生長相關(guān)占主位心臟TELOCYTES旁分泌作用能直接促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞自分泌血管內(nèi)皮生長因子釋放。

簡(jiǎn)介：廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所里交的學(xué)位論文，是個(gè)人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)特別加以注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明并致謝。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名_二疆日期矽，歸鑰，廠日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解廣州中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)保留使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許被查閱和借閱。本人授權(quán)廣州中醫(yī)藥大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)印手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定論文作者簽名囪查塹論文導(dǎo)師簽名日期為，肇年Q月，擴(kuò)日2．活動(dòng)期UC患者中醫(yī)干預(yù)組L與西醫(yī)治療組1兩組問血漿MMP一1、TIMP一1、PGE2表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義D0．05。3．緩解期UC患者中醫(yī)干預(yù)組2與西醫(yī)治療組2兩組間血漿MMP一1、TIMP一1、PGE2表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0．05。二血漿刪P一1、TIMPI、PGE2的表達(dá)水平與UC病情的關(guān)系1．血漿MMP一1、TIMP一1、PGE2在UC不同病情中的表達(dá)1血漿涮P一1在中度UC中的表達(dá)顯著高于輕度、緩解期UCP0．05。2血漿中TIMPI、PGE2在中度、輕度UC中表達(dá)均較緩解期組顯著增高KO．05，且中度UC中表達(dá)較輕度UC明顯增高P0．05。研究結(jié)論一、MIDP一1、TIMP一1、PGE2三因子在血漿中的表達(dá)與UC發(fā)病機(jī)制及病情密切相關(guān)。二、伏毒理論指導(dǎo)下的中醫(yī)藥治療UC在降低相關(guān)血漿細(xì)胞因子方面優(yōu)勢(shì)顯著，主要體現(xiàn)在緩解期，具體表現(xiàn)在降低MMP一1、TIMP一1水平方面。三、“伏毒”之“毒”與分子水平的MMP一1、TIMP一1存在一種客觀的比類關(guān)系，同時(shí)伏毒之“伏”亦體現(xiàn)在UC分期的緩解期。四、伏毒與UC的關(guān)系一定程度上實(shí)現(xiàn)了客觀化，促進(jìn)了中醫(yī)理論嚴(yán)謹(jǐn)化。關(guān)鍵詞潰瘍性結(jié)腸炎，中醫(yī)伏毒理論，發(fā)病機(jī)制，MMPL、TIMP一1、PGE2

簡(jiǎn)介：目的了解整合子在部分銅綠假單胞菌臨床分離株中的分布及耐藥性情況，分析整合子與銅綠假單胞菌耐藥和多重耐藥的相關(guān)性。了解整合子可變區(qū)攜帶的耐藥基因型，研究其分子生物學(xué)特征，探討整合子在細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生和傳播擴(kuò)散中的作用。材料與方法1菌株來源1997年至2003年問江蘇省人民醫(yī)院收集并隨機(jī)抽取的非重復(fù)性并具有臨床意義的銅綠假單胞茵菌株，共47株。2方法以煮沸法提取47株銅綠假單胞菌的總DNA為模板，根據(jù)1、3類整合子各自整合酶基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物，PCR擴(kuò)增以篩選出各自陽性菌株；再將整合子陽性菌株與銅綠假單胞菌PU21共孵，行轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)；采用瓊脂平皿稀釋法對(duì)47株菌株以及轉(zhuǎn)移接合子進(jìn)行MIC測(cè)定，分析藥敏情況。對(duì)1類整合子陽性菌株，根據(jù)1類整合子5’和3’保守區(qū)設(shè)計(jì)的通用可變區(qū)引物，PCR擴(kuò)增其可變區(qū)。將可變區(qū)PCR產(chǎn)物膠回收純化后，進(jìn)行序列分析，結(jié)果與GENBANK序列進(jìn)行比對(duì)，確定可變區(qū)所含耐藥基因盒。以1類整合子陽性菌株與其對(duì)應(yīng)接合子的總DNA為模板，根據(jù)1類整合子可變區(qū)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)所含耐藥基因盒對(duì)應(yīng)的引物，PCR擴(kuò)增每一個(gè)耐藥基因以確認(rèn)克隆測(cè)序結(jié)果及初步檢驗(yàn)整合子是否處于質(zhì)粒上。采用堿裂解法抽取整合子陽性菌株與其對(duì)應(yīng)接合子的質(zhì)粒。采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳PULSEDFIELDGELELECTROPHESIS，PFGE分析整合子陽性菌株的同源性。結(jié)果47株銅綠假單胞菌經(jīng)PCR法29株檢測(cè)到含有1類整合酶，占所有分離菌株的617％2947，3類整合子未檢出。藥敏結(jié)果顯示1類整合子陽性菌株較陰性菌株耐藥率明顯升高；整合子陽性菌株對(duì)哌拉西林、頭孢他啶、阿米卡星、慶大霉素、氯霉素、鏈霉素的耐藥率最高，達(dá)到100％。29株1類整合子陽性菌株均轉(zhuǎn)移接合成功；轉(zhuǎn)移接合子與野生株比較，對(duì)哌拉西林他唑巴坦、亞胺培南、環(huán)丙沙星均敏感，MIC90分別下降了8、128和128倍。29株攜帶的1類整合子可變區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物均約為43KB。序列分析結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)該可變區(qū)包含4個(gè)耐藥基因盒，形成一個(gè)新的組合形式AAC6’ⅡAADA13CMLA8OXA10，已提交GENBANK，序列號(hào)為EU182575。其中AADA13首次在銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)。同時(shí)第三個(gè)開放閱讀框的序列未見報(bào)道，與已知的CM1A5同源性最高為95％，將其命名為CM1A8。無論野生株或接合子經(jīng)PCR均分別擴(kuò)增出上述4個(gè)耐藥基因盒，序列測(cè)定與克隆測(cè)序一致。無論野生株或接合子均抽提出大小一致，大于10KB的耐藥性質(zhì)粒。脈沖場(chǎng)凝膠電泳的分析結(jié)果顯示，所有1類整合子陽性菌株具有高度同源性，存在克隆傳播和可能相關(guān)關(guān)系。結(jié)論本院銅綠假單胞菌臨床分離株中有1類整合子的流行。1類整合子陽性的菌株較陰性菌株對(duì)多種抗生素更容易產(chǎn)生耐藥。結(jié)合藥敏表型及整合子攜帶耐藥基因的基因型，整合子與銅綠假單胞茵耐藥和多重耐藥相關(guān)。和野生株相比，轉(zhuǎn)移接合子對(duì)哌拉西林他唑巴坦、亞胺培南、環(huán)丙沙星均敏感。該1類整合子可變區(qū)基因相同，攜帶有新的耐藥基因盒組合形式。整合子位于接合性質(zhì)粒。這些1類整合子陽性菌株間存在著水平或垂直傳播的可能性。

簡(jiǎn)介：安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文產(chǎn)SHV型超廣譜Β內(nèi)酰胺酶腸桿菌耐藥基因的分子生物學(xué)研究姓名盛大平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師徐元宏20050701MICMLNIMUMINHIBLTORYCONCENTRATION最低抑菌濃度NCCLSNATLONALCOMMTTEEFORCHNLCAL美國國家臨床實(shí)驗(yàn)LABORATORYSTANDARDS標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)PLISOELETRICPOINT等電點(diǎn)PFGEPULSEFIELDGELELECTROPHORESIS脈沖場(chǎng)電泳儀PCRPOLYMERASECHALNREACTION聚合酶鏈反應(yīng)KPNKLEBSIELLAEPNEUMONIAE肺炎克雷伯菌ECOESCHERICHIACOLI大腸埃希菌LEULLEUCINE亮氨酸GLNQGLUTAMINE谷氨酰胺GLYGGLYCINE甘氨酸SERSSERINE絲氨酸GLUEGLUTAMICACID谷氨酸LYSKLYCINE賴氨酸ARGRARGININE精氨酸THRTTHREONINE蘇氨酸ALAAALANINE丙氨酸VALVVALINE纈氨酸ASNNASPARAGINE天冬酰胺ASPDASPARTLCACID天冬氨酸ILEIISOLEUCINE異亮氨酸PROPPROLINE脯氨酸LEULLEUCINE亮氨酸METMMETHIONINE蛋氨酸TRPWTRPTOLPHAN色氨酸CYSCCYSTEINE半胱氨酸TYRYTYROSINE酪氨酸HISHHISTIDINE組氨酸3

簡(jiǎn)介：Y1407150分類號(hào)R75密級(jí)學(xué)位類別科學(xué)學(xué)位日專業(yè)學(xué)位口學(xué)校代碼10062學(xué)號(hào)20T52321天滓醬耕垮TIANJINMEOLCLUNIVERSLLLR碩士學(xué)位論文MASTER’SDISSERTATION論文題目蕈樣肉芽腫T細(xì)胞受體基因重排的分子生物學(xué)診斷研究TITLEMOLECULARDIAGNOSISOFMYCOSISFUNGOIDESWITHREARRANGEMENTOFTCELLRECEPTOR一級(jí)學(xué)科臨床醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科皮膚病與性病學(xué)論文作者徐敏指導(dǎo)教師紀(jì)巖文教授導(dǎo)師組成員張理濤副主任醫(yī)師天津醫(yī)科大學(xué)研究生院二OO八年五月天津醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文技術(shù)檢測(cè)TCR基因重排。且本方法省時(shí)省力，最大程度的避免在提取過程中DNA的損失。2．紅斑期蕈樣肉芽腫出現(xiàn)典型病理特征的比例較少，僅靠病理組織學(xué)診斷紅斑期蕈樣肉芽腫較為困難。斑塊期和腫瘤期蕈樣肉芽腫病理特征突出，診斷相對(duì)容易。3．研究結(jié)果顯示6L例蕈樣肉芽腫患者中82．0％發(fā)生TCR吖基因重排，其陽性率較高。4．對(duì)照組中亞急性皮炎、急性痘瘡樣糠疹和點(diǎn)滴型副銀屑病中也都有陽性克隆，尤其是亞急性皮炎的陽性率較高，提示有出現(xiàn)假陽性的可能。5．應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)MF石蠟包埋組織的TCRY基因重排，并結(jié)合臨床表現(xiàn)，病理和免疫組化等可用于MF的診斷。關(guān)鍵詞蕈樣肉芽腫；T細(xì)胞受體；基因重排基因診斷；聚合酶鏈反應(yīng)II

簡(jiǎn)介：分類號(hào)分類號(hào)R75105密級(jí)密級(jí)公開公開單位代碼單位代碼10760學(xué)號(hào)學(xué)號(hào)107601110534新疆醫(yī)科大學(xué)XINJIANGMEDICALUNIVERSITY博士學(xué)位論文士學(xué)位論文THESISOFDOCTORDEGREE臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)位臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)位學(xué)位教育學(xué)位教育論文題目論文題目氨甲環(huán)酸對(duì)培養(yǎng)氨甲環(huán)酸對(duì)培養(yǎng)人黑素細(xì)胞生物學(xué)影響和相關(guān)分子黑素細(xì)胞生物學(xué)影響和相關(guān)分子機(jī)制的研究機(jī)制的研究研究生研究生安彩霞安彩霞指導(dǎo)教師指導(dǎo)教師普雄明雄明教授教授專業(yè)學(xué)位領(lǐng)域?qū)I(yè)學(xué)位領(lǐng)域皮膚皮膚病與病與性病學(xué)性病學(xué)研究方向研究方向色素性皮膚病色素性皮膚病研究起止時(shí)間研究起止時(shí)間2012年3月2013年9月所在學(xué)院所在學(xué)院自治區(qū)人民醫(yī)院自治區(qū)人民醫(yī)院2013年10月ASTUDYONTHEBIOLOGICALEFFECTRELATEDMOLECULARMECHANISMOFTRANEXAMICACIDONMELANOGENESISINCULTUREDHUMANMELANOCYTESＡDISSERTATIONSUBMITTEDTOXINJIANGMEDICALUNIVERSITYINPARTIALFULLFILLMENTOFTHEREQUIREMENTSFTHEDEGREEOFDOCTOFMEDICINEBYANCAIXIADERMATOLOGYVENEREOLOGYDISSERTATIONSUPERVISPROFPUXIONGMINGOCT2013

簡(jiǎn)介：研究背景血管長期暴露于搏動(dòng)性血流的作用下，后者產(chǎn)生的機(jī)械生物力對(duì)于正常的血管結(jié)構(gòu)和功能的維持具有關(guān)鍵作用。血管中的搏動(dòng)性血流主要產(chǎn)生兩種形式的機(jī)械生物力，分別是平行于血管長軸的剪切力SHEARSTRESS和垂直于血管長軸的機(jī)械牽張力STRETCHSTRESS。內(nèi)皮細(xì)胞襯于血管最里面，直接與血流接觸，因此剪切力主要作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。而牽張力主要是由于心臟周期性搏動(dòng)引起的血管擴(kuò)張產(chǎn)生的，因此作用于血管各層細(xì)胞，但血管平滑肌細(xì)胞VSMCS是其主要的靶細(xì)胞。大量的體內(nèi)外研究證實(shí)，機(jī)械牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移以及表型等生物學(xué)功能。一般認(rèn)為，在正常情況下牽張力9％～12％ELONGATION抑制平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡等功能，對(duì)于維持血管平衡具有重要調(diào)節(jié)作用，而在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等病理情況下，異常增高的牽張力＞15％ELONGATION則促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等功能，誘導(dǎo)正常的血管結(jié)構(gòu)改變和功能失調(diào)。近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)機(jī)械牽張力調(diào)控平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的分子機(jī)制做了深入研究，認(rèn)為細(xì)胞表面具有力學(xué)信號(hào)感受作用的各種分子可以將胞外的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)的化學(xué)信號(hào)，通過激活一系列的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)各種基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞生物學(xué)功能改變。但是目前對(duì)這一機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的諸多機(jī)制尚不清楚，比如細(xì)胞表面是否存在特異性的力學(xué)信號(hào)感受分子，細(xì)胞內(nèi)各信號(hào)分子之間的相互作用模式，以及在轉(zhuǎn)錄水平之外的基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制等。進(jìn)一步深入了解牽張力調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的分子機(jī)制，對(duì)于尋找新的高血壓、冠心病等心血管疾病干預(yù)靶點(diǎn)具有重要的意義。MICRNASMIRNAS是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA分子，通過抑制靶基因的翻譯或促進(jìn)MRNA的降解在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。研究證實(shí)，MIRNAS在心血管系統(tǒng)的正常發(fā)育以及多種病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，MIRNAS也參與機(jī)械生物力調(diào)節(jié)血管細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，與靜止培養(yǎng)相比，剪切力誘導(dǎo)多個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞MIRNAS表達(dá)改變，其中MIR19A與MIR23B在剪切力調(diào)控細(xì)胞周期中發(fā)揮關(guān)鍵作用，MIR92A介導(dǎo)剪切力對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞NO的水平的調(diào)控。但是關(guān)于牽張力對(duì)血管細(xì)胞MIRNAS表達(dá)的影響，以及后者在牽張力介導(dǎo)的細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用目前還不清楚。MIR21是近年廣泛研究的一種MIRNA，其在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，具有顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡作用。此外，MIR21在血管細(xì)胞中也有豐富表達(dá)，并且在損傷血管中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)新生內(nèi)膜的形成。新近的研究發(fā)現(xiàn)，MIR21在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)受到剪切力的調(diào)節(jié)，并且不同形式的剪切力對(duì)MIR21表達(dá)的影響是不同的，MIR21分別在剪切力介導(dǎo)的內(nèi)皮炎癥、NO生成中發(fā)揮重要調(diào)控作用。MIR21在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)豐度明顯高于內(nèi)皮細(xì)胞中，鑒于MIR21在細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)節(jié)中的作用以及機(jī)械牽張力對(duì)平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，我們推測(cè)牽張力可能通過調(diào)節(jié)MIR21在血管平滑肌細(xì)胞中的水平影響細(xì)胞功能。目前對(duì)MIRNAS的研究多集中在其生物學(xué)效應(yīng)方面，而對(duì)MIRNAS本身的表達(dá)調(diào)控機(jī)制知之甚少，MIR21基因位于蛋白編碼基因之間，具有獨(dú)立的啟動(dòng)子區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)AP1，NFΚB等轉(zhuǎn)錄因子可能參與MIR21表達(dá)調(diào)控，但是在牽張力的作用下，參與調(diào)節(jié)MIR21表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子尚不明確。深入了解MIRNAS的表達(dá)調(diào)控機(jī)制有利于系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞功能的分子機(jī)制，因此，在本研究中我們也初步探討牽張力調(diào)節(jié)MIR21表達(dá)的上游分子機(jī)制。研究目的1在體外細(xì)胞水平，明確牽張力對(duì)血管平滑肌細(xì)胞MIR21表達(dá)的影響。2明確MIR21在牽張力介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡中的作用。3明確牽張力調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞MIR21表達(dá)的分子機(jī)制。研究方法1人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞HASMCS培養(yǎng)HASMCS細(xì)胞株購自美國SCIENCELL公司，細(xì)胞生長至完全融合后，吸去培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞一遍以去除殘留的血清，然后加入適量預(yù)熱的025％胰蛋白酶，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞細(xì)胞變圓后，吸去胰酶，加入新的平滑肌細(xì)胞完全培養(yǎng)基吹打均勻，轉(zhuǎn)入新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入含5％CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。2機(jī)械牽張力干預(yù)體外培養(yǎng)的HASMCS接種HASMCS至鋪有Ⅰ型鼠尾膠原的FLEXCELL6孔板中105細(xì)胞孔，待細(xì)胞生長至80％～90％融合時(shí)，利用無血清培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)24小時(shí)后，更換新的完全培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基，使用FLEXCELL5000細(xì)胞牽張力儀給予HASMCS不同強(qiáng)度的牽張力刺激，分組如下110％牽張力組分別給予最大牽拉強(qiáng)度為10％，頻率為1HZ的周期性牽張力分別刺激細(xì)胞0、3、6、12、24小時(shí)。216％牽張力組分別給予最大牽拉強(qiáng)度為16％，頻率為1HZ的周期性牽張力分別刺激細(xì)胞0、3、6、12、24小時(shí)。3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MIR21表達(dá)水平使用INVITROGEN公司的TRIZOL提取包含MIRNAS的HASMCS總RNA，利用丹麥EXIQON公司的MIRNDNA合成試劑盒和MIRNASSYRBGREENMASTERMIX試劑盒分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，小RNAU6作為各樣本MIR21表達(dá)水平的內(nèi)參照，每組樣本重復(fù)檢測(cè)4次。U6及MIR21PCR引物均購自EXIQON公司。4細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用INVITROGEN公司的LIPOFECTAMINE2000分別轉(zhuǎn)染不同濃度的MIR21INHIBIT和MIMICS，調(diào)節(jié)HASMCSMIR21的表達(dá)水平，化學(xué)修飾的MIR21INHIBIT和MIMICS均由上海吉瑪公司合成，轉(zhuǎn)染PDCD4表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)HASMCSPDCD4蛋白水平。轉(zhuǎn)染細(xì)胞48小時(shí)后，給予細(xì)胞牽張力刺激，觀察相應(yīng)的細(xì)胞功能或目的蛋白水平變化。5HASMCS增殖檢測(cè)牽張力干預(yù)體外培養(yǎng)的HASMCS12小時(shí)，利用美國羅氏公司的BRDU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)牽張力對(duì)HASMCS增殖的影響轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT或MIMICS48小時(shí)后，再給予牽張力干預(yù)12小時(shí)后，BRDU摻入法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)HASMCS增殖水平，明確MIR21在牽張力介導(dǎo)的HASMCS增殖中的作用。6WESTERNBLOT牽張力刺激HASMCS結(jié)束后，提取胞漿蛋白，測(cè)定蛋白濃度后加蛋白上樣緩沖液煮沸5分鐘。取15～20UG蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳，利用WESTERNBLOT分別檢測(cè)P27，PRB，以及PDCD4蛋白表達(dá)。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)4次，ΒACTIN作為內(nèi)參。7細(xì)胞凋亡檢測(cè)利用BIPEC公司的ANNEXINVFITCAPOPTOSISDETECTIONKIT檢測(cè)HASMCS凋亡情況。牽張力干預(yù)結(jié)束后，用胰酶消化的方法收集細(xì)胞，每個(gè)樣本用400ULBINDINGBUFFER重懸，經(jīng)過15分鐘的ANNEXINVFITC標(biāo)記，5分鐘PI標(biāo)記后，在1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞流式分析，每個(gè)樣本在流式分析中計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞。8實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定PRIMIR21、PREMIR21、PDCD4MRNA水平牽張力刺激HASMCS結(jié)束后，利用TRIZOL提取細(xì)胞總RNA。使用日本TAKARA公司的CDNA合成試劑盒將樣本總RNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNA，然后利用TAKARA公司的SYBRGREEN實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR引物由上海吉瑪公司合成。PCR反應(yīng)結(jié)束后得到CT值，并計(jì)算2△△CT，ΒACTIN作為PRIMIR21、PREMIR21、PDCD4MRNA表達(dá)水平的內(nèi)參。9細(xì)胞免疫熒光16％牽張力刺激體外培養(yǎng)的HASMCS3小時(shí)后，利用免疫熒光方法觀察CFOS、CJUN的表達(dá)變化。牽張力刺激細(xì)胞結(jié)束后，免疫染色固定液固定30分鐘，PBS沖洗后加01％TRITONX100室溫下孵育8分鐘，繼之用5％BSA封閉30分鐘，經(jīng)PBS沖洗后4℃條件下分別孵育CFOS，CJUN抗體CELLSIGNALINGTECHNOLOGY1∶200過夜，次日，經(jīng)過熒光二抗孵育1小時(shí)，DAPI染核后，在激光共聚焦顯微鏡下，觀察目的蛋白的表達(dá)水平。10凝膠遷移實(shí)驗(yàn)EMSA利用EMSA方法檢測(cè)16％牽張力對(duì)轉(zhuǎn)錄因子AP1與NFΚB活性的影響。牽張力干預(yù)平滑肌細(xì)胞結(jié)束后，利用PIERCE細(xì)胞核蛋白提取試劑盒收集細(xì)胞核蛋白，并利用BCA方法檢測(cè)核蛋白的濃度。使用T4連接酶在AP1與NFΚB雙鏈核苷酸探針末端標(biāo)記Γ32PATP，取8UG核蛋白與標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄因子探針及試劑盒其它成分共計(jì)20UL預(yù)混后，冰上孵育30分鐘，然后用4％非變性膠進(jìn)行電泳，根據(jù)PIERCEEMSA試劑盒說明書操作具體步驟。11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用SPSS130統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組之間的比較采用非配對(duì)T檢驗(yàn)，多組之間的比較采單因素方差分析，P＜005認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1機(jī)械牽張力對(duì)體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞HASMCSMIR21表達(dá)水平的影響研究結(jié)果顯示，在無血清條件下，與靜止培養(yǎng)的細(xì)胞相比，16％牽張力自6小時(shí)開始顯著上調(diào)體外培養(yǎng)的HASMCSMIR21的表達(dá)水平，上調(diào)趨勢(shì)保持到24小時(shí)，表達(dá)高峰在12小時(shí)P＜001）而10％牽張力對(duì)HASMCSMIR21的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響P＞005）。在有血清刺激的條件下，16％牽張力仍然持續(xù)上調(diào)MIR21的表達(dá)P＜001，但上調(diào)幅度沒有無血清條件下明顯而10％牽張力明顯抑制MIR21的表達(dá)，與靜止對(duì)照相比，MIR21的表達(dá)6小時(shí)開始顯著下調(diào)P＜005，12小時(shí)下調(diào)最明顯。2MIR21在機(jī)械牽張力調(diào)控人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用利用BRDU摻入法與細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法檢測(cè)MIR21在牽張力調(diào)節(jié)的HASMCS增殖中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與靜止培養(yǎng)的細(xì)胞相比16％牽張力顯著增強(qiáng)HASMCS的增殖水平轉(zhuǎn)染MIR21抑制物INHIBIT抑制MIR21的水平，結(jié)果與MIRNA陰性對(duì)照INHIBIT相比，MIR21的表達(dá)水平下調(diào)42倍P＜001，而轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT的HASMCS增殖水平顯著下降P＜001。同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，利用胰酶消化的方法收集細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示與BRDU摻入法一致P＜005。由于在含血清條件下，10％牽張力抑制MIR21的表達(dá)，轉(zhuǎn)染化學(xué)修飾的MIR21類似物MIMICS上調(diào)MIR21的表達(dá)水平，結(jié)果顯示MIR21MIMICS升高M(jìn)IR21的表達(dá)70倍P＜001）而BRDU摻入法結(jié)果顯示，與靜止培養(yǎng)的HASMCS相比，10％牽張力顯著抑制細(xì)胞的增殖水平P＜001，而轉(zhuǎn)染MIR21MIMICS顯著降低10％牽張力對(duì)HASMCS增殖的抑制作用P＜005。WESTERNBLOT結(jié)果顯示16％牽張力抑制細(xì)胞周期抑制因子P27的表達(dá)，促進(jìn)PRB的表達(dá)P＜001而與轉(zhuǎn)染MIRNA陰性對(duì)照INHIBIT相比，MIR21INHIBIT部分逆轉(zhuǎn)16％牽張力對(duì)P27，PRB表達(dá)的影響P＜001）。3MIR21在機(jī)械牽張力介導(dǎo)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡中的作用利用ANNEXINFITC與PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)牽張力對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示與靜止對(duì)照組比較，16％牽張力增加體外培養(yǎng)的HASMCS凋亡水平919±066VS133±012，P＜001轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT抑制MIR21的水平，結(jié)果顯示與陰性對(duì)照MIRNAINHIBIT相比較，MIR21INHIBIT顯著增強(qiáng)了16％牽張力對(duì)HASMCS的促凋亡作用255±161VS938±157，P＜001在靜止培養(yǎng)的HASMCS中，轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT對(duì)細(xì)胞凋亡沒有顯著的影響。在有血清條件下，對(duì)靜止對(duì)照組相比較，10％牽張力對(duì)HASMCS的凋亡沒有顯著影響P＞005。4PDCD4在16％牽張力介導(dǎo)的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡中的作用利用TAKARACDNA合成與SYBRGREENPCR定量試劑盒檢測(cè)16％牽張力對(duì)HASMCSPDCDMRNA水平的影響，結(jié)果顯示與靜止對(duì)照組相比，16％牽張力增加PDCD的MRNA水平198倍P＜005，而WESTERNBLOT結(jié)果顯示，16％牽張力顯著抑制PDCD的蛋白水平055倍P＜005）。轉(zhuǎn)染MIR21INHIBIT后，16％牽張力對(duì)HASMCSPDCD4蛋白水平的抑制作用明顯減輕P＜005。為明確PDCD4在牽張力誘導(dǎo)的HASMCS凋亡中的作用，轉(zhuǎn)染PDCD4表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)其蛋白表達(dá)水平，再給予16％牽張力刺激，細(xì)胞流式結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PDCD4表達(dá)質(zhì)粒明顯促進(jìn)16％牽張力的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用P＜001）。516％牽張力對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞AP1、NFΚB活性的影響利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)16％牽張力對(duì)HASMCSMIR21轉(zhuǎn)錄初級(jí)產(chǎn)物PRIMIR21，前體PREMIR21水平的影響，結(jié)果顯示對(duì)靜止對(duì)照相比，16％牽張力分別增加PRIMIR21水平173倍P＜005，PREMIR21水平285倍P＜001。AP1、NFΚB是介導(dǎo)機(jī)械牽張力調(diào)控平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的重要轉(zhuǎn)錄因子，在特定條件下也參與MIR21的表達(dá)調(diào)控。WESTERNBLOT結(jié)果顯示，16％牽張力明顯增加NFΚBP65的磷酸化水平，高峰在牽張力干預(yù)后1、3小時(shí)，至6小時(shí)恢復(fù)至靜止對(duì)照水平，而16％牽張力對(duì)NFΚBP65的蛋白水平?jīng)]有顯著影響16％牽張力持續(xù)引起CJUN的表達(dá)水平和磷酸化水平顯著增高，但對(duì)CFOS蛋白的表達(dá)水平及磷酸化水平?jīng)]有明顯影響。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，16％牽張力增加CJUN在細(xì)胞核中的表達(dá)，而增加CFOS在胞漿中的表達(dá)，CFOS在胞核中的表達(dá)沒有顯著變化。EMSA結(jié)果顯示，16％牽張力顯著增加HASMCSAP1與NFΚB的活性P＜005。6AP1、NFΚB在16％牽張力誘導(dǎo)HASMCSMIR21表達(dá)中的作用利用LIPO2000轉(zhuǎn)染CJUNSIRNA下調(diào)HASMCSCJUN的表達(dá)，16％牽張力干預(yù)HASMCS前1小時(shí)，加入NFΚB抑制劑SN50抑制其活性P＜001。結(jié)果顯示，CJUNSIRNA明顯抑制HASMCS中CJUN的表達(dá)，16％牽張力誘導(dǎo)的AP1活性顯著下降P＜001。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，CJUNSIRNA抑制16％牽張力誘導(dǎo)的MIR21表達(dá)P＜001，而SN50對(duì)16％牽張力誘導(dǎo)的MIR21表達(dá)沒有明顯作用P＞005。結(jié)論116％機(jī)械牽張力上調(diào)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞MIR21的表達(dá)，而在有血清條件下，10％牽張力抑制MIR21的表達(dá)水平。2MIR21參與介導(dǎo)機(jī)械牽張力調(diào)節(jié)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖與凋亡的作用。3機(jī)械牽張力通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子AP1CJUN的活性上調(diào)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞MIR21表達(dá)。

簡(jiǎn)介：蘇州大學(xué)碩士學(xué)位論文惡性血液病患者侵襲性曲霉菌感染的早期抗原和分子生物學(xué)診斷研究姓名徐明珠申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)血液病學(xué)指導(dǎo)教師孫愛寧20090501惡性血液病患者侵襲性曲霉菌感染的早期抗原和分子生物學(xué)診斷研究中文摘要為75．1％，陰性預(yù)測(cè)值為100％，三者聯(lián)合，診斷的敏感度明顯提高，特異度僅輕度下降。4本研究中的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，三種檢測(cè)方法陽性結(jié)果出現(xiàn)均比臨床痰培養(yǎng)及典型影像學(xué)表現(xiàn)要早表3．6，REALTIMEPCR結(jié)果提示陽性較GM，BG抗原檢測(cè)要提前，但T檢驗(yàn)盧O．824，戶O．641，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。538例完成針對(duì)曲霉菌感染搶先治療的患者，按療效分為有效組及無效組，分別于靜脈抗真菌藥物使用前一3、0、3、7、1L、15D，6個(gè)時(shí)點(diǎn)檢測(cè)GM，BG，CT均值，結(jié)果如下A．治療有效組GM值呈下降趨勢(shì)并降至正常，治療無效組GM值反而上升。對(duì)無效組與有效組在不同檢測(cè)時(shí)點(diǎn)GM值總體分布位置進(jìn)行WILCOXON秩和檢驗(yàn)。有效組與無效組在治療前GM值分布無差異PO．864，在治療7D后其檢測(cè)值分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0．05，治療后在各檢測(cè)時(shí)點(diǎn)其CT值差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義PO．05。因此，動(dòng)態(tài)檢測(cè)GM，BG抗原對(duì)抗真菌療效的評(píng)價(jià)有著一定的意義，而動(dòng)態(tài)監(jiān)NCT值對(duì)評(píng)價(jià)療效無顯著性意義。結(jié)論血清BG，GM抗原檢測(cè)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以為早期診斷IA提供有力證據(jù)，聯(lián)合BG，GM抗原兩種檢測(cè)方法有利于判斷假陽性試驗(yàn)結(jié)果，動(dòng)態(tài)檢測(cè)GM、BG抗原水平，有利于判斷療效及預(yù)后；REALTIMEPCR，以標(biāo)本兩孔CT均值430定義為陽性，可以獲得較高的敏感度及特異度，動(dòng)態(tài)監(jiān)NCT值對(duì)評(píng)價(jià)療效無顯著性意義。關(guān)鍵詞曲霉病；血液??；半乳甘露聚糖；1，3一BD葡聚糖；REALTIMEPCR；診斷H作者徐明珠指導(dǎo)老師孫愛寧