簡(jiǎn)介：河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)及知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬承諾本學(xué)位論文在導(dǎo)師或指導(dǎo)小組的指導(dǎo)下，由本人獨(dú)立完成。本學(xué)位論文研究所獲得的研究成果，其知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。河北醫(yī)科大學(xué)有權(quán)對(duì)本學(xué)位論文進(jìn)行交流、公開和使用。凡發(fā)表與學(xué)位論文主要內(nèi)容相關(guān)的論文，第一署名單位為河北醫(yī)科大學(xué)，試驗(yàn)材料、原始數(shù)據(jù)、申報(bào)的專利等知識(shí)產(chǎn)權(quán)均歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。否則，承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。一虢香緋靳虢形那日河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注等內(nèi)容外，文中不包含其他人已發(fā)表或撰寫的研究成果，指導(dǎo)教師對(duì)此進(jìn)行了審定。本論文由本人獨(dú)立撰寫，文責(zé)自負(fù)。研究生簽名砑匈囂導(dǎo)師簽章紗F年6月7日目錄中文摘要1英文摘要3研究論文兒童感染流感嗜血桿菌分子生物學(xué)鑒定及分型研究前言5剛舌5材料與方法6結(jié)果14附圖16附表21討念24結(jié)論28參考文獻(xiàn)29綜述流感嗜血桿菌分型的研究進(jìn)展34致謝44個(gè)人簡(jiǎn)歷45

簡(jiǎn)介：溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文前列腺癌外周血微轉(zhuǎn)移的免疫磁珠分選和分子生物學(xué)檢測(cè)姓名沈默申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師陶志華陳曉東20080501溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文周血微轉(zhuǎn)移發(fā)生的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)。結(jié)果1、成功建立免疫磁珠法檢測(cè)外周血微轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞的方法學(xué)。隨著PSMA單克隆抗體濃度的增高，LNCAP細(xì)胞與免疫磁珠的結(jié)合率也增高。當(dāng)單抗?jié)舛葹?,UG／ML時(shí)，結(jié)合率最高，玫瑰花環(huán)形成率可達(dá)到90％，單抗?jié)舛壤^續(xù)增加，二者結(jié)合率不再升高并略有下降。且分選后癌細(xì)胞存活率較之分選前未明顯改變。該方法敏感性高，當(dāng)PBMC與LNCAP細(xì)胞比例為1061時(shí)可以檢測(cè)到癌細(xì)胞，檢測(cè)靈敏度可達(dá)20個(gè)腫瘤細(xì)胞／ML外周血。2、臨床病例檢測(cè)結(jié)果5例正常對(duì)照者中未檢測(cè)到陽性結(jié)果；30例BPH患者中檢測(cè)到1例陽性；53例前列腺癌患者中有23例陽性，陽性率43．4％，其中ECT證實(shí)的27例骨轉(zhuǎn)移癌患者中，有17例陽性，陽性率達(dá)到63％。結(jié)論免疫磁珠法是一種高效、快捷、靈敏、特異并且臨床實(shí)用價(jià)值高的檢測(cè)技術(shù)，可為臨床早期發(fā)現(xiàn)前列腺癌微小殘留提供新的思路，其聯(lián)合實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR方法判斷前列腺癌患者外周血微轉(zhuǎn)移的發(fā)生有助于轉(zhuǎn)移前列腺癌的早期診斷及其治療和預(yù)后判斷。關(guān)鍵詞免疫磁珠分選；前列腺癌；微轉(zhuǎn)移；前列腺特異抗原；逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)2

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多蚊蟲抗菌肽defensin的分子生物學(xué)研究及其與登革Ⅱ型病毒感染關(guān)系的探討.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文滑膜肉瘤的組織病理學(xué)，免疫組織化學(xué)及分子生物學(xué)研究姓名楊翎申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)病理學(xué)指導(dǎo)教師范欽和馮振卿200404202免疫組織化學(xué)SP法標(biāo)記抗體，36例滑膜肉瘤病例中，腫瘤細(xì)胞土皮樣細(xì)胞包括艨渲樣結(jié)構(gòu)區(qū)域C＆陽妊27例750％，EMA陽性30侈4833％，梭形細(xì)胞區(qū)域VIM陽性35例972％，DES陽蛀4鍘IL。L籬，ST00茸蛙1鍘28鬣，PGP鞠穗26倒722強(qiáng)，PCNAFEL陛33例917％；DES和S一100均為局灶或散在弱陽性。其中E受或EMA≯霹性合同時(shí)F隧蛀，VIM闋時(shí)F酲性31倒861％；CK和EMA均陰性，VILLL陽性4例111％；CK和EMA均陰性，VIM陰性1側(cè)28％。SMA均為陰性。3每次實(shí)驗(yàn)均檢測(cè)到看家基因PBGDRNRNA的表迭。20例被檢測(cè)滑膜肉瘸中，18例90％檢測(cè)到融合基因SYTSSX的表達(dá)。其中SYTSSXL型占L2侈667％，SYTSSX2型占6移4333強(qiáng)。12欏4SYT～SSXL融合基因檢測(cè)陽性的滑膜肉瘸標(biāo)本中，9例75％為單相型滑膜肉瘤，余3例為雙翻窒。6鍘SYTSSX2融合基西檢測(cè)稿蛀敲滑貘肉瘤標(biāo)本中，4例667％為單相型滑膜肉瘤余2例為雙相型?？p論1滑膜肉瘤的確診有賴于四方面的資料1臨床資料青壯年，發(fā)生于四肢大關(guān)節(jié)附近軟組織中的腫塊。2光學(xué)顯微鏡觀察，有雙相分化的線索如腺腔樣結(jié)構(gòu)；腮大細(xì)胞的出現(xiàn)更支持診斷的作出。3免疫組織化學(xué)標(biāo)記，出現(xiàn)上皮性抗體CK或EMA和溺葉性抗體VIM的同時(shí)表達(dá)，進(jìn)一步支持診斷。4分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)RTPCR，檢測(cè)到轉(zhuǎn)異性易位TX；LG

簡(jiǎn)介：論文題目越屋疸太鼠塑圈腿史亞￡二塑Y豎￡的筮王生物堂塞達(dá)拯壘迦蘭地Q過墓的王亟答辯委員會(huì)主席沈曄教授浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院答辯委員會(huì)成員沈曄主席施明光教授溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院鄭海華教授溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院論文答辯日期2013年5月26日溫州醫(yī)學(xué)院碩上學(xué)位論文英文縮略詞表英文縮寫AGNCONCXCR4DMDREPCHSCPBSRTPCRSDFLSDSPAGESPFSTZVEGFWB英文全稱ANTAGONISTSGROUPCONTROLGROUPCXCCHEMOKINERECEPTOR4DIABETETSMELLITUSGROUPDIABETICRETINOPATHYENDOTHELIALPROGENITORCEILHEMATOPOIETICSTEMCELLPHOSPHATEBUFFEREDSALINE中文全稱拮抗劑組對(duì)照組趨化因子受體CXCR4糖尿病組糖尿病視網(wǎng)膜病變內(nèi)皮祖細(xì)胞造血干細(xì)胞磷酸鹽緩沖液REVERSETRANSERIPTI。NP。1YMERASE逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)CHAINREACTIONSTROMALCELLDERIVODFACTOR1基質(zhì)細(xì)胞衍生因子一1SODIUMDODECYLSULFATE十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰POLYACRYLAMIDEGELELECTROPHERESIS胺凝膠電泳SPECIFICPATHOGENFREE無特定病原體STREDTOZOTOCIN鏈脲佐菌素VASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTOR血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子WESTERNBLOT蛋白免疫印跡

簡(jiǎn)介：博士學(xué)位論文學(xué)校代碼10023學(xué)號(hào)B2008162膀胱癌分子分型和分子網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)生物學(xué)研究ANINTEGRATIVESTUDYONMOLECULARCLASSIFICATIONANDMOLECULARNETWORKSOFBLADDERUROTHELIAICARCINOMA所院姓名指導(dǎo)教師導(dǎo)師小組學(xué)科專業(yè)研究方向完成日期北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所鄭陽高燕寧程書鈞張開泰壽建忠腫瘤學(xué)基礎(chǔ)癌發(fā)生演進(jìn)的分子機(jī)理和分子標(biāo)志2011年5月目錄圖表索引VI英文縮略詞VLLL摘要”IXABSTRACT”XL第一章導(dǎo)論1一、膀胱癌的概述L二、基因芯片技術(shù)及其應(yīng)用”31基因芯片的種類一311用于分析基因組結(jié)構(gòu)改變312用于分析基因組功能改變32基因芯片技術(shù)在腫瘤研究與臨床實(shí)踐中的應(yīng)用43利用基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)生物學(xué)的研究531系統(tǒng)生物學(xué)的概述532基因芯片在系統(tǒng)生物學(xué)研究中的應(yīng)用”6三、膀胱癌相關(guān)基因組結(jié)構(gòu)與功能改變的研究一61膀胱癌相關(guān)基因組結(jié)構(gòu)的異常改變62膀胱癌相關(guān)基因組功能的異常改變73膀胱癌的系統(tǒng)生物學(xué)研究8四、問題與展望9五、本課題的研究目的和研究策略10第二章以DNA拷貝數(shù)改變鑒別非浸潤(rùn)性與浸潤(rùn)性膀胱癌的研究12一、結(jié)果121膀胱癌組織的ARRAYCGH分析一1211獲得高質(zhì)量基因組DNA”1212酶切GDNA1213GDNA的標(biāo)記、純化以及與基因芯片雜交1314雜交后芯片數(shù)據(jù)的提取132膀胱癌組織ARMYCGH實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析142145例膀胱癌組織中GDNA異常改變情況142265例膀胱癌樣品基因組DNA變化情況15221芯片數(shù)據(jù)均一化L5222基因組DNA拷貝數(shù)改變情況L7223對(duì)ARMYCGH芯片分析結(jié)果的組織樣品驗(yàn)證20I

簡(jiǎn)介：T細(xì)胞的有效活化需要雙信號(hào)其中共刺激分子在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用B7H3是共刺激分子B7家族成員之一。人B7H3有兩種不同形式的剪切體2IGB7H3和4IGB7H3。2IGB7H3胞外段由IGVIGC兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成而4IGB7H3胞外段由IGV1IGC1IGV2IGC2四個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成。研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)4IGB7H3是人各組織細(xì)胞中B7H3的主要表達(dá)形式目前仍缺乏對(duì)兩種剪切體的差異研究。許多共刺激分子分別以細(xì)胞膜型和可溶型兩種形式存在。本實(shí)驗(yàn)室在健康人外周血和組織液中發(fā)現(xiàn)存在天然形式的SB7H3且發(fā)現(xiàn)SB7H3僅源于2IGB7H3。基因序列研究發(fā)現(xiàn)4IGB7H3胞外段4個(gè)結(jié)構(gòu)域是由編碼2IGB7H3IGV和IGC外顯子復(fù)制的結(jié)果2IGB7H3和4IGB7H3兩種剪切體的同源性超過95％本研究通過氨基酸序列比對(duì)和分析發(fā)現(xiàn)在人4IGB7H3分子第一個(gè)C樣免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域碳端末端存在一段獨(dú)特的氨基酸序列為“PQRSPT”其在2IGB7H3分子序列中缺失。本研究以此為出發(fā)點(diǎn)獲得了增加“PQRSPT”基序的2IGB7H3ADD基因和缺失“PQRSPT”基序的4IGB7H3DEL基因并構(gòu)建相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株以此來探討“PQRSPT”基序在人B7H3基因生物學(xué)功能及可溶性B7H3產(chǎn)生過程中的分子機(jī)制。㈠2IGB7H3ADD與4IGB7H3DEL基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立。RTPCR法分別擴(kuò)增2IGB7H3與4IGB7H3編碼區(qū)全長(zhǎng)基因并通過拼接PCR的方法獲得增加“PQRSPT”基序的2IGB7H3ADD基因和缺失“PQRSPT”基序的4IGB7H3DEL基因。將兩個(gè)目的基因片段雙酶切后與PIRES20EGFP真核表達(dá)載體連接構(gòu)建重組子PIRES2EGFP2IGB7H3ADD和PIRES2EGFP4IGB7H3DEL經(jīng)測(cè)序鑒定正確后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將兩個(gè)重組載體分別導(dǎo)入小鼠L929細(xì)胞。RTPCR結(jié)果表明表明導(dǎo)入的外源性2IGB7H3ADD和4IGB7H3DEL基因已分別成功整合到L929細(xì)胞基因組中并能成功地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GFP和B7H3蛋白在兩株細(xì)胞表面均穩(wěn)定高表達(dá)；WESTERNBLOT分析結(jié)果顯示L9292IGB7H3ADD和L9294IGB7H3DEL細(xì)胞均能成功表達(dá)B7H3蛋白。㈡“PQRSPT”基序在人B7H3基因生物學(xué)功能中的分子機(jī)制研究。收集上述基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA和WESTERNBLOT分析結(jié)果顯示在2IGB7H3和4IGB7H3DEL基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在可溶性B7H3蛋白而4IGB7H3和2IGB7H3ADD基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清與對(duì)照組一樣都未檢測(cè)出可溶性形式的存在。該研究結(jié)果表明保守性氨基酸“PQRSPT”可能是人4IGB7H3不能形成可溶性形式的一個(gè)重要基序。同時(shí)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞與外周血T細(xì)胞共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及分泌細(xì)胞因子的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)2IGB7H3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞能顯著地促進(jìn)T細(xì)胞體外增殖與細(xì)胞因子IL2和IFNΓ的分泌相比之下增加“PQRSPT”基序的2IGB7H3ADD基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞則無此效應(yīng)4IGB7H3基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞能顯著抑制T細(xì)胞的增殖與細(xì)胞因子IL2和IFNΓ的分泌而缺失“PQRSPT”基序的4IGB7H3DEL基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞則無明顯作用。以上研究結(jié)果均證實(shí)“PQRSPT”基序可能是4IGB7H3分子中的功能結(jié)構(gòu)域且對(duì)B7H3生物學(xué)功能的改變具有重要作用。㈢本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了L9292IGB7H3ADD和L9294IGB7H3DEL兩株轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株培養(yǎng)上清中SB7H3的檢測(cè)結(jié)果表明了“PQRSPT”基序與人4IGB7H3分子不能分泌可溶性形式密切相關(guān)。T細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)顯示兩株基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞均對(duì)T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌無效應(yīng)表明“PQRSPT”基序可能是4IGB7H3分子發(fā)揮抑制作用的重要基序。上述結(jié)果為進(jìn)一步闡明SB7H3的來源機(jī)制提供新的思路以及為研究人B7H3兩種剪切體的差別性奠定了分子基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：【目的】本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖翘接懸环N簡(jiǎn)便的適合漢族人的RHD基因分型方法并應(yīng)用該方法初步分析RHD陰性伴抗D個(gè)體的分子生物學(xué)特征為指導(dǎo)RHD陰性患者合理用血及RHD陰性產(chǎn)婦產(chǎn)后是否要進(jìn)行RHD免疫球蛋白干預(yù)治療提供初步的理論依據(jù)。【方法】1利用PCRSSP技術(shù)對(duì)116例標(biāo)本RHD特異性外顯子7和內(nèi)含子4進(jìn)行篩查。2對(duì)內(nèi)含子4和外顯子7篩查為陰性標(biāo)本運(yùn)用PCRSSP技術(shù)檢測(cè)RHD基因啟動(dòng)子和外顯子10。3對(duì)外顯子7和內(nèi)含子4陽性及啟動(dòng)子和外顯子10篩查陽性的標(biāo)本進(jìn)行RHD特異性的外顯子3、4、5、6、7、9檢測(cè)。4內(nèi)含子4和外顯子7為陽性的標(biāo)本使用BAGENERHDTYPEASIA試劑盒檢測(cè)RHDK409K。5通過PCRSSP的方法對(duì)檢測(cè)出的RHDK409K標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】1116例標(biāo)本中有83例為RHD基因缺失占715％有8例為RHD基因外顯子2～9缺失占69有24例為DELK409K占2072抗D組23例標(biāo)本均為RHD基因缺失。3在27例無抗D組中10例為DEL2例RHD外顯子2～9缺失15例RHD基因缺失?！窘Y(jié)論】1本基因分型方法簡(jiǎn)便可快速對(duì)RHD陰性標(biāo)本中RHD基因進(jìn)行初步分型。2RHD基因缺失為RHD陰性血型的主要分子生物學(xué)特征。3DEL為RHD陰性血型的次主要分子生物學(xué)特征。4攜帶DEL的個(gè)體是否可以接收RHD陽性輸血及DEL孕婦產(chǎn)后是否需要接受抗D免疫球蛋白預(yù)防注射還需進(jìn)一步研究。

簡(jiǎn)介：復(fù)旦大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文ARDS行控制性肺膨脹的分子生物學(xué)機(jī)制研究STUDYONMOLECULARMECHANISMOFSUSTAINEDINFLATIONINACUTERESPIRATYDISTRESSSYNDROME院系華山醫(yī)院專業(yè)急診醫(yī)學(xué)姓名方勇導(dǎo)師曹同瓦教授導(dǎo)師小組祝禾辰教授趙鋒主治醫(yī)師復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文ARDS行控制性肺膨脹的分子生物學(xué)機(jī)制研究縮略詞中英文對(duì)照表英文縮寫英文全稱中文全稱ALIACUTELUNGINJURY急性肺損傷AQP1AQUAPIN1水通道蛋白IAQP5AQUAPIN5水通道蛋白5ARDSACUTERESPIRATYDISTRESSSYNDROME急性呼吸窘迫綜合征COCARDIACOUTPUT心排出量CPAPCONTINUOUSPOSITIVEAIRWAYPRESSURE持續(xù)氣道正壓CSTSTATICLUNGCOMPLIANCE靜態(tài)肺順應(yīng)性ELISAENZYMELINKEDIMMUNOSBENTASSAY酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)FI02FRACTIONOFINSPIREDOXYGEN吸入氧濃度FLIPFLICELIKEINHIBITYPROTEINFLICE樣抑制蛋白HMGB1HIGHMOBILITYGROUPBOX1高遷移率族蛋白】ILLPINTERLEUKIN1P白介素13IL6LNTERLEUKIN6白介素6IL10INTERLEUKIN10白介素10MAPMEANARTERIALPRESSURE平均動(dòng)脈壓PAWPPULMONARYARTERYWEDGEPRESSURE肺動(dòng)脈楔壓RTPCRREALTIMEPOLYMERASECHAINREACTION實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PA02PARTIALPRESSUREOFOXYGENINARTERY動(dòng)脈氧分壓PEEPPOSITIVEENDEXPIRATYPRESSURE呼氣末正壓PIPPEAKINSPIRATYPRESSURE氣道峰壓PMNPOLYMPHONUCLEARNEUTROPHILS多形核中性粒細(xì)胞RAIRWAYRESISTANCE氣道阻力RMRECRUITMENTMANEUVER肺復(fù)張SISUSTAINEDINFLATION控制性肺膨脹SPASURFACTANTPROTEINA表面活性蛋白ATNFATUMNECROSISFACTALPHA腫瘤壞死因子A

簡(jiǎn)介：全文分上、下兩篇上篇睪丸功能相關(guān)HRABJMRABJ全長(zhǎng)新基因的分子克隆與生物學(xué)功能研究我們發(fā)現(xiàn)了人和小鼠的一個(gè)優(yōu)勢(shì)表達(dá)于睪丸組織的新型RAB分子其獨(dú)特地同時(shí)擁有兩個(gè)家族分子RAB和DNAJHSP40的特點(diǎn)結(jié)合免疫組織化學(xué)和亞細(xì)胞定位研究我們推測(cè)RABJ的主要生物學(xué)功能是在睪丸組織中通過介導(dǎo)HSC70向核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)共同調(diào)控機(jī)體對(duì)熱應(yīng)激的防護(hù)從而參與睪丸的生精過程由于我們克隆了小鼠的RABJ分子因此將非常有利于RABJ在生殖和發(fā)育中的功能和機(jī)制的探討下篇一種新型參與細(xì)胞內(nèi)吞的RAB分子全長(zhǎng)新基因的克隆和生物學(xué)功能研究我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)參與內(nèi)吞的新型RAB分子其廣泛表達(dá)于多種組織和細(xì)胞系而且在瞬時(shí)高表達(dá)后可以增強(qiáng)細(xì)胞的內(nèi)吞效應(yīng)因此我們認(rèn)為RAB39是一個(gè)在多種組織和細(xì)胞中發(fā)揮介導(dǎo)內(nèi)吞功能的新型RAB蛋白但是RAB39的作用機(jī)制尚不清楚亞細(xì)胞共聚焦顯微鏡定位及分布裂解可能有助于該問題的解決在RAB39的蛋白序列中有兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)提示RAB39可能參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或受其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子如MAPK家族分子的調(diào)控另外由于RAB39廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞系中其潛在的免疫學(xué)功能也有待于進(jìn)一步的研究

簡(jiǎn)介：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院2008級(jí)博士學(xué)位論文上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文ALCL基因在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制研究研究生姓名季曉頻研究生學(xué)號(hào)0087209114培養(yǎng)單位瑞金醫(yī)院學(xué)科專業(yè)外科學(xué)導(dǎo)VILI朱正綱教授導(dǎo)師組成員劉炳亞教授于穎彥教授趙任主任醫(yī)師燕敏主任醫(yī)師論文答辯日期二O一一年五月本課題由上海市科委重點(diǎn)課題10JCL411100上海市胃腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科委重點(diǎn)課題09DZ2260200上海市重點(diǎn)學(xué)科夕’科學(xué)課題30204上海市重大科技專項(xiàng)09DZL950100資助上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院2008級(jí)博士學(xué)位論文上海交通大學(xué)上JJI母交通大字學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)上海交通大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于保密口，在一年解密后適用本授權(quán)書。不保密彳請(qǐng)?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打“4”學(xué)位論文作者簽名日翅、11年R月7曰／沙IIJ喉似繕怕各R簽?zāi)杲碳x導(dǎo)【甑匕日一韶一

簡(jiǎn)介：目的男男性接觸者M(jìn)ENWHOHAVESEXWITHMEN，MSM指與其他男性進(jìn)行性行為的男性，包括同性戀，雙性戀，異性戀和易性者。1981年，艾滋病首先在美國(guó)一組男同性戀者中被確認(rèn)。MSM成為世界上第一個(gè)被確認(rèn)的艾滋病高危人群。全球HIV監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，近年來MSM人群的HIV1感染率有上升趨勢(shì)。我國(guó)最新的艾滋病疫情報(bào)告也顯示，新發(fā)男男性接觸感染者連續(xù)幾年呈明顯上升趨勢(shì)，2011年48萬HIV1新發(fā)感染中，同性傳播占294％，MSM已成為新發(fā)感染數(shù)最大的高危人群。因此，目前最迫切的工作是加深對(duì)MSM人群HIV1感染情況的了解，明確MSM人群中主要流行毒株及其流行規(guī)律，為有針對(duì)性的制定預(yù)防控制措施提供理論基礎(chǔ)。多位學(xué)者的研究表明，56％92％的新感染是由處在急性期的感染者傳播的還有研究顯示，這些引起感染的毒株可能是被選擇出來傳播給新宿主的。對(duì)經(jīng)異性傳播HIV1感染者的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)生殖道粘膜屏障傳播的毒株存在明顯的傳播瓶頸效應(yīng)，大多數(shù)建立有效的感染HIV1傳播是由單一的TRANSMITTEDFOUNDERVIRUSES（TF毒株）引起的。因此，如果在病毒尚未廣泛擴(kuò)散及整合形成病毒潛伏庫(kù)時(shí)進(jìn)行有針對(duì)性的治療，建立感染的病毒和病毒感染的細(xì)胞是有可能被清除的。然而由于難以獲得感染早期病毒復(fù)制的粘膜部位標(biāo)本，目前對(duì)于這些引起HIV1傳播和感染的TF毒株的生物學(xué)特性和進(jìn)化的分子機(jī)制仍不清楚。而且，男性和女性在泌尿生殖道和直腸的解剖學(xué)和免疫組織學(xué)上存在較大差異，使得上述對(duì)異性傳播感染者實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果并不完全適用于解釋MSM中傳播的TF毒株的特征及在HIV1傳播和建立持續(xù)感染中的作用。此外，由于HIV1具有眾多亞型，病毒基因組序列高度多樣化而且通過不同途徑傳播的TF毒株在基因型和表現(xiàn)型方面存在明顯的差異。因此，為了尋找更好地控制HIV1在MSM人群中的傳播蔓延并改善臨床預(yù)后的方法，就需要進(jìn)一步深入開展MSM人群HIV1主要流行的TF毒株的生物學(xué)特征及致病機(jī)理等基礎(chǔ)研究。由于HIV感染缺乏理想的動(dòng)物模型，HIV的體外感染性分子模型即感染性分子克隆成為不可或缺的一種重要研究工具，也為開展該病毒的分子致病機(jī)理、基因組結(jié)構(gòu)與功能等基礎(chǔ)應(yīng)用研究提供了前提條件。但目前世界上現(xiàn)有的感染性分子克隆大都是利用歐美和非洲國(guó)家的B和C亞型毒株構(gòu)建而成，并不適用針對(duì)中國(guó)HIV1主要流行毒株的研究。目前，我國(guó)對(duì)MSM人群中HIV1感染者的研究主要為HIV1感染率及社會(huì)學(xué)和行為學(xué)的調(diào)查，僅有數(shù)篇小樣本MSM人群HIV1感染者的病毒亞型分析的報(bào)道，而關(guān)于該人群HIV1感染主要流行株的遺傳學(xué)和病毒學(xué)特性的信息較少。我國(guó)至今僅有來源于既往有償獻(xiàn)血員中流行的B啞型以及IDUS感染者中流行的CRF07_BC和CRF08_BC亞型的感染性分子克隆，尚未見目前新發(fā)感染數(shù)最大的高危人群MSM中主要流行毒株感染性分子克隆的相關(guān)報(bào)道，更無其早期傳播毒株感染性分子克隆的報(bào)道。綜上所述，本研究在全國(guó)第二大MSM聚集地的遼寧省，對(duì)MSM中的HIV1感染者進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，明確在我國(guó)MSM中主要流行的病毒亞型，并選取其中有代表性的早期傳播毒株分離其原代病毒株，并進(jìn)行感染性分子克隆的構(gòu)建，借助此感染性分子克隆對(duì)MSM中主要流行毒株進(jìn)行生物學(xué)特性研究，為探討MSM中HIV1快速傳播的機(jī)制以及研發(fā)有效的抗病毒藥物和疫苗等方面的研究提供良好的技術(shù)平臺(tái)。方法一、研究對(duì)象229名經(jīng)男男性接觸感染HIV1的成年（18歲以上）男性。征得患者的知情同意后進(jìn)行面對(duì)面問卷調(diào)查采集相關(guān)流行病學(xué)信息，所有病例均否認(rèn)靜脈吸毒史和賣輸血史，在采集血樣時(shí)均未接受任何抗艾滋病毒治療采集EDTA抗凝外周靜脈血，6小時(shí)內(nèi)常規(guī)離心，分離血漿，分裝后80℃低溫保存。二、實(shí)驗(yàn)方法（一）病毒核酸提取以140ΜL血漿按照QIAAMPVIRALRNAMINIKIT說明書步驟提取病毒基因組RNA。以1106個(gè)細(xì)胞按照QIAAMPDNABLOODMINIKIT說明書步驟提取前病毒基因組DNA。（二）PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化及基因序列測(cè)定使用反轉(zhuǎn)錄PCR和套式PCR方法，分別擴(kuò)增POL基因NT22523299，蛋白酶199密碼子和反轉(zhuǎn)錄酶1250密碼子和ENV基因NT70117715，C2V5。PCR產(chǎn)物純化參照QIAQUICKGELEXTRACTIONKIT操作步驟。利用測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，純化后上機(jī)檢測(cè)。（三）序列分析采用BIOEDIT軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯處理，然后進(jìn)行拼接。用MEGA50軟件自展法BOOTSTRAP重復(fù)運(yùn)算1000次構(gòu)建NEIGHBJOININGNJ進(jìn)化樹。利用MEGA軟件中的DISTANCE程序中的KIMURA雙參數(shù)方法計(jì)算序列間的基因離散率。用HIVDATABASE中VESPA軟件分析兩個(gè)流行簇毒株遺傳變異特征HIGHLIGHTER軟件對(duì)序列進(jìn)行比較，并標(biāo)記出匹配不匹配、有義無義突變及超突變等特征。用GENO2PHENO軟件預(yù)測(cè)對(duì)病毒的輔助受體使用情況。（四）病毒載量測(cè)定以1ML血漿采用標(biāo)準(zhǔn)版模板制備法提取RNA，使用COBASAMPLIPREPCOBASTAQMANHIV120ROCHE以TAQMANRTPCR方法測(cè)定病毒載量。（五）HIV1抗體檢測(cè)1、ELISA法使用法國(guó)生物梅里埃公司第三代檢測(cè)試劑盒，參照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。2、WB法使用新加坡MP生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司人類免疫缺陷病毒HIV12型抗體檢測(cè)試劑盒，參照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。（六）SGA法擴(kuò)增近全長(zhǎng)序列及基因序列測(cè)定使用反轉(zhuǎn)錄PCR和套式PCR方法，分別擴(kuò)增5AMPLICONNT6345066和3AMPLICONNT49009612。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至華大基因科技有限公司（北京）進(jìn)行WALKINGSEQUENCING。（七）擴(kuò)增全長(zhǎng)序列及基因序列測(cè)定使用套式PCR方法，分別擴(kuò)增5HALFGENOMENT15066和3HALFGENOMENT49009719。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至華大基因科技有限公司（北京）進(jìn)行WALKINGSEQUENCING。（八）分子克隆1、半分子克隆參照TOPOXLPCRCLONINGKIT說明書，純化PCR產(chǎn)物后，進(jìn)行TOPO克隆反應(yīng)和化學(xué)轉(zhuǎn)化，構(gòu)建半分子克隆。2、質(zhì)粒提取及基因序列測(cè)定參照QIAPREPSPINMINIPREPKIT說明書提取半分子克隆的質(zhì)粒DAN進(jìn)行酶切、電泳鑒定。經(jīng)鑒定已插入目的片段的半分子克隆送至華大基因科技有限公司（北京）進(jìn)行WALKINGSEQUENCING。3、全基因組克隆及基因序列測(cè)定分別將5和3半分子克隆用NDEⅠ和NOTⅠ雙酶切并純化后，分別回收85KB和5KB片段在T4DNA連接酶作用下，于4℃連接過夜經(jīng)酶切和電泳鑒定已插入目的片段的全基因組克隆送至華大基因科技有限公司（北京）進(jìn)行WALKINGSEQUENCING。（九）質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染參照FUGENE6TRANSFECTIONREAGENT說明書將全基因組克隆轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)48小時(shí)，取200ΜL上清進(jìn)行HIV1P24抗原檢測(cè)，2ML凍存于156℃。（十）WB法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況參照分子克隆提取轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞的蛋白，進(jìn)行SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，分別與一抗和二抗封閉作用后，參照ECL顯色試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。（十一）HIV1病毒分離利用密度梯度離心法分離正常人和HIV1感染者的PBMC采用PBMC共培養(yǎng)法復(fù)制病毒。每34天換液1次，每7天添加1次經(jīng)PHA刺激生長(zhǎng)3天的正常淋巴細(xì)胞。定期對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞上清中的HIV1P24抗原含量進(jìn)行檢測(cè)。（十一）HIV1病毒生物學(xué)特性研究利用TZMB1細(xì)胞檢測(cè)病毒感染性，利用PBMC檢測(cè)病毒復(fù)制能力，利用GHOSTCD4CXCR4CCR5細(xì)胞檢測(cè)病毒輔助受體利用情況。（十二）HIV1P24抗原檢測(cè)參照美國(guó)ZEPTOMETRIX公司HIV1P24抗原定量檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。（十三）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究涉及統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性分析均采用SPSS180軟件包處理。結(jié)果一、MSM人群中流行的HIV1主要基因型及其特征研究（一）遼寧省MSM人群HIV1感染者基因亞型分布及與全國(guó)流行毒株的關(guān)系利用NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹綜合分析POL和ENV基因序列，發(fā)現(xiàn)我省MSM人群HIV1感染者中存在CRF01_AE、BB、CRF07_BC3種亞型。其中CRF01_AE亞型占856％196229，BB亞型占96％22229，CRF07_BC占35％8220。其中CRF01_AE亞型毒株主要分為兩簇，CLUSTER1毒株與我國(guó)其他地區(qū)MSM中流行毒株聚集成簇，推測(cè)其與我國(guó)MSM中廣泛流行毒株具有更近的遺傳親緣關(guān)系CLUSTER2毒株雖人數(shù)眾多，但組內(nèi)基因距離較小，同源性較高，且與我省經(jīng)異性傳播毒株距離較近，提示可能經(jīng)異性接觸傳入，由奠基者效應(yīng)引起在遼寧省內(nèi)MSM人群的擴(kuò)散傳播。（二）遼寧省MSM人群HIV1感染者基因亞型分布的歷年演變情況20002010每年新確診病例中CRF01_AE亞型均占720％以上，為遼寧省MSM人群主要的HIV1流行毒株。其中CLUSTER1上升趨勢(shì)顯著，而CLUSTER2自2008年開始下降。相同的趨勢(shì)也出現(xiàn)在2009年和2010年新發(fā)現(xiàn)的急性HIV1感染者中。因此，推測(cè)雖然CLUSTER2毒株在遼寧省MSM中感染者存在一定的奠基者效應(yīng)，而CLUSTER1毒株近年來增加較快，值得關(guān)注。（三）遼寧省MSM人群HIV1感染者中流行的CRF01AE毒株V3區(qū)氨基酸特征V3區(qū)頂端四肽是最重要的中和抗體決定簇，CLUSTER1毒株主要表現(xiàn)為GPGQ而CLUSTER2毒株主要為GPGR，兩者存在顯著性差異。經(jīng)比較CLUSTER1和CLUSTER2毒株在輔助受體利用情況上無差異，均以CCR5作為輔助受體為主。CLUSTER1和CLUSTER2毒株在V3區(qū)的氨基酸序列主要存在4個(gè)特征性氨基酸位點(diǎn)，分別位于第13、18、19和32位。其中第18位氨基酸位于頂端四肽，第13、18和19位氨基酸存在電荷差異，主要表現(xiàn)為CLUSTER1為帶正電荷，而CLUSTER2為帶負(fù)電荷。這些氨基酸電荷的差異會(huì)引起蛋白空間構(gòu)象的不同，從而直接影響病毒的生物學(xué)性質(zhì)。與我國(guó)其他地區(qū)MSM中流行的CRF01_AE亞型毒株比較后發(fā)現(xiàn)，CLUSTER1毒株與其在這幾個(gè)位點(diǎn)上的特征性氨基酸組成更為類似。因此，推測(cè)CLUSTER1和CLUSTER2毒株可能具有不同的生物學(xué)特性，而CLUSTER1毒株與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)MSM中流行的毒株有更相似的生物學(xué)特征。二、MSM中HIV1急性感染者代表性病毒株的選取及其病毒生物學(xué)特性研究（一）代表性毒株的選擇選取CLUSTER1中的急性感染者為研究對(duì)象。結(jié)合病毒RNA、抗體WB檢測(cè)結(jié)果及流行病學(xué)資料，對(duì)基因序列分析后，選擇資料完整的患者320008為研究對(duì)象進(jìn)行下一步驗(yàn)證。獲得其感染第30天（第一點(diǎn)，F(xiàn)IEBIGⅣ期，僅有血漿樣本）、第47天（第二點(diǎn)，F(xiàn)IEBIGⅥ期，保留血漿和PBMC樣本）和第54天（第三點(diǎn)，F(xiàn)IEBIGⅥ期，保留血漿和PBMC樣本）血漿病毒RNA進(jìn)行近全長(zhǎng)序列擴(kuò)增。比較后發(fā)現(xiàn)在第二、三點(diǎn)與第一點(diǎn)高度相似，但存在3個(gè)可遺傳的有義突變，分別位于GAG基因P17末端423，TAT基因第一外顯子末端70，ENV基因C4起始位置2，而且第二點(diǎn)與第三點(diǎn)病毒相比擁有較少的G＞A超突變和GAG區(qū)的變異，意味著第三點(diǎn)病毒受宿主免疫壓力的影響較大，從而推測(cè)第二點(diǎn)病毒應(yīng)是更接近建立感染的早期傳播毒株。利用SGA方法擴(kuò)增第二點(diǎn)樣本的近全長(zhǎng)序列，分別比較其5和3AMPLICON的序列后發(fā)現(xiàn)，序列間核苷酸變異率較小，組內(nèi)遺傳距離均為0001±0000。由此可知，第二點(diǎn)5和3SGAAMPLICON的遺傳同質(zhì)性均較高，因此推斷第二點(diǎn)病毒還是單一的毒株，受宿主免疫壓力影響較小，仍具有建立感染的早期傳播毒株的特征且與現(xiàn)有CRF01_AE亞型感染性分子克隆的基因距離較遠(yuǎn)，推測(cè)這些感染性分子克隆與我國(guó)MSM人群中流行的CRF01AE亞型的早期傳播毒株在某些生物學(xué)特性上可能會(huì)存在差異，并不適用于研究我國(guó)MSM人群的HIV1主要流行毒株的生物學(xué)特征及致病機(jī)理等基礎(chǔ)研究。（二）早期傳播毒株原代病毒的分離及其病毒生物學(xué)特性利用PBMC共培養(yǎng)法，我們成功分離了前期選取的患者320008感染第47天的原代病毒08ISO，其能感染TZMB1和PBMC細(xì)胞，并可在其中復(fù)制，且復(fù)制水平較高，以CCR5作為輔助受體，具有巨噬細(xì)胞嗜性的特性，是具有早期傳播毒株表型特征的原代病毒。綜上，我們獲得了一株具有高度遺傳同質(zhì)性、有感染和傳播能力的代表性毒株，其在基因型和表型上都具備早期傳播毒株的特征。三、CRF01AE亞型HIV1早期傳播毒株感染性分子克隆的構(gòu)建及其生物學(xué)特征的初步研究（一）320008毒株全基因組克隆的構(gòu)建與鑒定320008原代病毒08ISO體外培養(yǎng)后，提取前病毒基因組DNA，兩段法分別擴(kuò)增5半分子5LTRVIF15066NT和3半分子VIF3LTR，49009719NT后，分別克隆入TOPOPCRXL載體構(gòu)建成半分子克隆，再利用NDEⅠ酶切位點(diǎn)連接為全基因組克隆。其基因序列結(jié)果顯示，全基因組克隆包括完整的HIV1結(jié)構(gòu)，且無移碼突變和終止密碼。經(jīng)NJ系統(tǒng)樹分析表明，其與病毒RNA近全長(zhǎng)的共享序列高度同源，且與前期研究中CRF01AECLUSTER1中毒株聚集成簇，遠(yuǎn)離現(xiàn)有的來源于慢性經(jīng)異性傳播CRF01AE亞型感染者的感染性分子克隆。（二）320008衍生病毒的產(chǎn)生及其HIV1主要結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)情況全基因組克隆轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48小時(shí)后，收集上清檢測(cè)其HIV1P24抗原，均在1105PGML以上，說明有衍生病毒產(chǎn)生。利用WESTERNBLOTTING技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞，其結(jié)果顯示有GP160，GP120，GP41，P64，P53，P24和P17等蛋白表達(dá)，提示我們構(gòu)建的全基因組克隆可以在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄并翻譯出HIV1的結(jié)構(gòu)和功能蛋白，并被細(xì)胞蛋白酶很好地切割，具備了組裝HIV1_病毒顆粒的條件，是具有感染性的全基因組克隆即感染性分子克隆08IMC。（三）感染性分子克隆生物學(xué)特性的研究感染性分子克隆08IMC轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，收獲的衍生病毒能感染TZMB1和PBMC細(xì)胞，并可在其中復(fù)制，但衍生病毒的復(fù)制水平顯著低于其原代病毒08ISO與原代病毒08ISO的情況一致，衍生病毒也以R5作為輔助受體，具有巨噬細(xì)胞嗜性的特性，。因此，我們獲得的感染性分子克隆08IMC也具有早期傳播毒株的特征。結(jié)論1CRF01AE是遼寧省MSM人群中主要流行的HIV1亞型，主要分為兩大簇，其中近年來增加較快的CLUSTER1與CLUSTER2在V3區(qū)氨基酸特征上存在顯著差異，而與我國(guó)其他地區(qū)MSM中流行的毒株相似，基因距離較近，具有較近的親緣關(guān)系。2篩選CLUSTER1毒株，選取一例感染47天處于FIEBIGⅥ期的感染者320008分離其原代病毒08ISO并檢測(cè)其病毒生物學(xué)特性，結(jié)果顯示其病毒RNA具有較高的遺傳同質(zhì)性，是早期感染的單一毒株原代病毒08ISO可以利用CCR5輔助受體感染TZMB1細(xì)胞和PBMC，并可在其中復(fù)制，且復(fù)制水平較高。由此可以確定原代病毒08ISO是目前在我國(guó)MSM人群中主要流行的CRF01_AE亞型毒株中具有代表性的有感染和傳播能力的早期傳播毒株。3利用08ISO構(gòu)建的感染性分子克隆08IMC與目前我國(guó)MSM人群中主要流行的CRF01AE毒株遺傳距離接近，同源性較高，有較近的親緣關(guān)系其衍生病毒與原代病毒生物學(xué)性質(zhì)相似，因此可以認(rèn)為感染性分子克隆08IMC是目前我國(guó)MSM中主要流行的CRF01AE早期傳播毒株的感染性分子克隆。

簡(jiǎn)介：本研究利用共聚焦顯微鏡觀察了未成熟樹突狀細(xì)胞對(duì)凋亡腫瘤細(xì)胞的攝取，采用流式細(xì)胞術(shù)和3HTDR摻入實(shí)驗(yàn)研究了CD40和TNFR信號(hào)對(duì)凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載的樹突狀細(xì)胞表型的促成熟作用和促T細(xì)胞增殖效應(yīng)，采用胞內(nèi)染色、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA探討了CD40配基化的腫瘤特異性樹突狀細(xì)胞對(duì)TH細(xì)胞的極化作用，結(jié)果表明，凋亡腫瘤細(xì)胞負(fù)載的樹突狀細(xì)胞在CD40信號(hào)的作用下能進(jìn)一步成熟，分化成為功能性的腫瘤特異性樹突狀細(xì)胞，其在體外能有效介導(dǎo)TH1效應(yīng)細(xì)胞的分化，并且此極化TH潛能和其表面B7H3分子的高表達(dá)相關(guān)。本研究結(jié)果還提示采用CD40信號(hào)激發(fā)的腫瘤特異性樹突狀細(xì)胞有望成為腫瘤免疫治療的新手段。

簡(jiǎn)介：HMGB1表達(dá)下調(diào)表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及能的影響及初步初步分子分子機(jī)制探討機(jī)制探討李人立培養(yǎng)類別全日制學(xué)位類型學(xué)術(shù)學(xué)位一級(jí)學(xué)科專業(yè)類臨床醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科專業(yè)外科學(xué)（普外）研究方向胃癌機(jī)制研究指導(dǎo)教師包國(guó)強(qiáng)副教授（副主任醫(yī)師）培養(yǎng)單位唐都醫(yī)院普外科二O一五年五月分類號(hào)Q28UDC601密級(jí)公開第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文目錄縮略語表1中文摘要3英文摘要5前言8文獻(xiàn)回顧9正文19實(shí)驗(yàn)一HMGB1表達(dá)下調(diào)胃癌細(xì)胞系的建立及鑒定191材料1911細(xì)胞系與質(zhì)粒1912主要試劑和儀器192方法2121HMGB1基因RNAI慢病毒載體的構(gòu)建2122慢病毒小量包裝及其滴度測(cè)定2323胃癌細(xì)胞慢病毒感染2424RTPCR內(nèi)源篩選有效靶點(diǎn)2625WESTERNBLOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá)273結(jié)果2731慢病毒干擾載體GV155HMGB1陽性克隆PCR鑒定2732慢病毒干擾載體GV155HMGB1的DNA測(cè)序結(jié)果2833慢病毒包裝與病毒滴度測(cè)定2834RTPCR內(nèi)源篩靶結(jié)果2935WESTERNBLOT驗(yàn)證結(jié)果304討論30實(shí)驗(yàn)二HMGB1表達(dá)下調(diào)對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響321材料32

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