ALC1基因在結直腸癌中的生物學作用及其分子機制研究.pdf

1、研究背景與目的:隨著生活環(huán)境和飲食結構的變化，我國結直腸癌的發(fā)病率以及死亡人數(shù)呈不斷上升趨勢。因其早期癥狀不明顯，在已確診患者中進展期占大多數(shù)，是對生命威脅程度較大的消化道腫瘤之一。由于結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多階段、多因素參與的復雜過程，其中涉及一系列基因的激活或失活，因此深入理解結直腸癌的發(fā)病機制將有助于進一步提高早期診斷率、提供新的治療手段和改善預后。近年來細胞遺傳學的研究發(fā)現(xiàn)，在人類眾多惡性上皮性腫瘤中存在染色體1q或1q部分

2、區(qū)段的高頻擴增。2008年Guan等應用染色體微切割及雜交流選擇技術，從肝癌細胞的1q21.1高擴增區(qū)段克隆了一個新的候選癌基因:AmplifiedinLiverCancer1(ALC1)。由于結直腸癌中也存在1q或1q部分區(qū)段的高頻擴增，那么在結直腸癌中是否也存在著ALC1基因的擴增與異常表達？其是否與腫瘤的惡性進展密切相關？能否成為評估腫瘤預后的新分子標記物？目前國內外尚未見文獻報道。因此，本課題旨在探索ALC1基因在結直腸癌中的擴

3、增與表達情況及其臨床病理學意義;同時研究ALC1的異常表達與結直腸癌細胞增殖、生長、遷移和侵襲及凋亡的相關性，以期闡明ALC1在結直腸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，并且進一步探尋其作用機制。
　　材料和方法:
　　應用免疫組化、定量RT-PCR、免疫印跡和熒光原位雜交的方法，檢測ALC1基因在86例原發(fā)性結直腸癌中的表達與擴增，并結合腫瘤的臨床病理學特點和預后資料，分析它們之間的相關性。在ALC1基因功能的體外研究中，我們構建pcD

4、NA3.1(+)-ALC1的表達質粒，轉染結腸癌細胞SW1116并篩選穩(wěn)定表達的克隆，觀察ALC1對SW1116結腸癌細胞體外增殖能力、細胞周期、凋亡、遷移侵襲能力及體內成瘤能力的影響。為研究ALC1過表達后對下游基因的調控，我們選用Affymetrix人全基因組芯片U133plus2.0進行cDNA微陣列實驗，對ALC1高表達和空載體對照SW1116細胞進行差異表達基因分析。
　　結果:
　　在86例原發(fā)性結直腸癌中61.

5、6％的患者出現(xiàn)ALC1蛋白的過度表達;而全部的癌旁和正常腸粘膜組織未發(fā)現(xiàn)ALC1蛋白的過度表達。ALC1蛋白表達與較大的腫瘤直徑、較深的浸潤程度和較高的組織學分級均有顯著的相關性(P值均＜0.05)。在49例成功進行FISH檢測和分析的結直腸癌病例中，有9例檢測到ALC1基因的擴增，其中8例存在ALC1蛋白的過度表達，明顯高于ALC1基因未擴增病例中40％(16/40)的蛋白過度表達率(P=0.011)。生存分析顯示，ALC1蛋白表達陽

6、性的患者預后明顯差于表達陰性的患者;在無病生存期(DFS)中表現(xiàn)得尤為顯著(P=0.003)而兩組患者的總生存期(OS)則沒有統(tǒng)計學上的顯著差異(P=0.14)。
　　定量RT-PCR和蛋白印跡結果均顯示在6株結直腸癌細胞株中ALC1的表達程度不同，其表達水平在SW480細胞中較高而在SW1116細胞中則相對較低;pcDNA3.1-ALC1轉染SW1116細胞后則能顯著提高其表達45.5土4.2倍。體內外功能實驗發(fā)現(xiàn)上調ALC1的

7、表達能促進結直腸癌細胞的增殖、遷移(ALC1組和pcDNA3.1穿過人工基底膜的細胞數(shù)分別是152±18個和58±8個細胞)、侵襲(ALC1組和pcDNA3.1組穿過小室底內膜的細胞數(shù)分別是51±6個和18±3個細胞)及裸鼠體內的成瘤能力(ALC1組和pcDNA3.1組在裸鼠皮下形成腫瘤的重量分別是1.223±0.047g和0.926±0.033g)。流式細胞儀檢測顯示ALC1轉染組與SW1116未轉染組和pcDNA3.1轉染組相比較，

8、細胞凋亡率顯著降低(2.3±0.6％vs.5.9±0.9％;2.3±0.6％vs.6.4±1.0％;p＜0.05)，同時增加G2/M期細胞數(shù)量(16.02±0.53％vs.6.84±0.16％，p＜0.05)，從而促進有絲分裂。cDNA微陣列分析篩選出1786個與ALC1功能相關的基因，其中1072個基因表達上調，714個基因表達下調。其中Thrombospondin1(TSP-1)水平下調97％(倍數(shù)變化:0.03)，其下游的FYN、

9、cd36、C-Fos基因表達同時下調，從而造成細胞凋亡降低，腫瘤微血管生成增加。
　　結論:
　　ALC1在結直腸癌組織中的表達明顯增高并且其表達水平與腫瘤大小、浸潤深度、組織分化程度和無病生存期均密切相關;ALC1基因的擴增可能在其蛋白過度表達中起著重要的作用。ALC1基因表達能夠促進結直腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲和裸鼠體內的腫瘤形成能力;ALC1基因表達能夠抑制結直腸癌細胞的凋亡，同時增加G2/M期細胞數(shù)量，從而促進有絲