簡介：登革病毒（DENGUEVIRUS屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種單股正鏈的RNA病毒，全長約11KB，含有一個單一的開放讀碼框，開放讀碼框可依次編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、PRM和E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）。結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒與宿主細胞的吸附及病毒顆粒的組裝；其中E蛋白是對病毒感染起保護性免疫作用的抗原。非結(jié)構(gòu)蛋白則主要在病毒基因組的復制和翻譯過程中發(fā)揮重要作用1。登革病毒（DENGUEVIRUS，DEN）包括4個血清型（DENV1型，DENV2型，DENV3型，DENV4型），其引起的登革熱是世界上分布最廣、發(fā)病人數(shù)最多、危害最嚴重的蚊媒疾病，廣泛流行于全球100多個國家2。由其感染所引起的疾病包括無癥狀感染、一般性發(fā)熱、溫和的登革熱（DENGUEFEVER，DF）以及嚴重的登革出血熱（DENGUEHEMRHAGICFEVER，DHF）和登革休克綜合征（DENGUESHOCKSYNDROME，DSS）3。接種疫苗是控制登革熱最重要的手段。由于抗體依賴增強感染效應ANTIBODYDEPENDENTENHANCEMENTADE，理想的登革疫苗應該是能夠誘導人體產(chǎn)生4種血清型DENV均有免疫保護作用46。進展最快的登革疫苗是法國賽諾菲巴斯德公司的登革四價減毒活疫苗（CYDTDV），該疫苗已經(jīng)完成三期臨床試驗，于2016年1月份在墨西哥率先上市臨床數(shù)據(jù)顯示，該疫苗抵抗DENV1、DENV3、DENV4的有效率分別為503％、740、777，但抗DENV2的有效率只有42378。該嵌合疫苗是以黃病毒家族（YF17D）毒株骨架，再以4個血清型DENV病毒的同源序列（PRME）替換骨架病毒的相應基因得到的重組嵌合毒株，從而獲得合適的減毒效率和較強的免疫原性910。我國研制的乙腦減毒活疫苗SA14142于1989年在中國被批準上市，目前為止，已經(jīng)有超過3億兒童接種疫苗。研究顯示，該疫苗株具有良好的減毒特性和安全性，單次免疫能有效誘導產(chǎn)生保護性的中和抗體，而且免疫力持久1113。由于黃病毒的基因機構(gòu)、復制翻譯策略都非常相似，可以用分子生物學的方法相互改變黃病毒的基因，以構(gòu)建新的嵌合病毒1416。李曉峰等17將DENV2的PREME蛋白基因成功插入SA14142為骨架中，構(gòu)建了CHINDENV2型嵌合疫苗，該嵌合病毒在小鼠和靈長類動物上具有減毒效果。本研究擬以乙腦減毒活疫苗SA14142為骨架，將登革4型病毒PREME蛋白編碼基因替換進SA14142基因中，繼續(xù)構(gòu)建DENV4型嵌合疫苗，初步完成乙腦登革4型嵌合病毒的構(gòu)建與生物學性質(zhì)評價。本研究包括以下兩個部分一、乙腦登革4型嵌合病毒的構(gòu)建。嵌合病毒是利用反向遺傳學的方法，由結(jié)構(gòu)功能相似的同源或者異源病毒相互替換部分結(jié)構(gòu)基因而獲得的一種新的病毒，為了保證重組病毒的安全性，我們一般采用已知特性的病毒株，一般多選用減毒株作為病毒載體。本研究利用乙腦減毒活疫苗SA14142為骨架，我們采用分子生物學的方法將疫苗株的PRM和E蛋白編碼基因替換為登革4型病毒（DENV4GZ30）的PRM和E蛋白的相應部分，構(gòu)成一種新的嵌合質(zhì)粒，命名為PCHINDENV4。通過酶切圖譜初步確定嵌合質(zhì)粒的大小和完整性進一步測定質(zhì)粒的全基因序列運用DNASTAR軟件比對嵌合質(zhì)粒與病毒基因序列的差異。利用體外轉(zhuǎn)錄的方法，將嵌合質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄成RNA，并且轉(zhuǎn)染BHK21細胞，約3天后細胞出現(xiàn)典型病變后，得到嵌合病毒。通過反轉(zhuǎn)錄PCR實驗判斷病毒是否正確。測病毒CDNA序列，比對是否與原質(zhì)粒序列相同。實驗結(jié)果表明，我們能通過反向遺傳學的方法成功拯救出乙腦登革4型嵌合病毒。嵌合病毒能夠在BHK21細胞上復制。二、乙腦登革4型嵌合病毒生物學特性評價。我們對嵌合病毒與其親本病毒在不同細胞系中的生長特性進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與親本病毒株相比無顯著差異。進一步對嵌合病毒的蝕斑特征及在動物體內(nèi)的神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力進行了測定，結(jié)果顯示嵌合病毒的蝕斑大小介于兩親本株之間，其神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力與親本株弱。綜上，本研究采用反向遺傳學的方法，構(gòu)建了一種新的登革乙腦嵌合病毒，通過將嵌合病毒與其親本病毒株生物學特性鑒定和比較，我們發(fā)現(xiàn)嵌合病毒在細胞上的復制生長能力沒有降低，但毒力較其親本病毒株減弱，乙型登革病毒反向遺傳學系統(tǒng)的建立為基因乙腦疫苗株骨架的新型登革病毒四價疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

簡介：近年來，再發(fā)及新發(fā)病毒性流行病時常發(fā)生，對人類和動物的健康和生命造成嚴重的威脅，已成為全人類面臨的公共衛(wèi)生性難題。人類的很多病毒性傳染病通常都與動物有著密切的關(guān)系。鼠類與人類的生活接觸較為密切，而且鼠類攜帶有大量的致病性病毒如引起腎綜合征出血熱HFRS的HANTAVIRUS、Y引起人拉撒熱的沙粒病毒科病毒（ARENAVIRIDAE）、導致人類急性胃腸炎發(fā)生的諾瓦克病毒、引起高至死率的HANTAVIRUSPULMONARYSYNDROME（HPS）的SINNOMBREVIRUS（SNV）等。因而，了解和掌握鼠類攜帶病毒的情況對于防控及治療鼠源病毒性流行病具有重要的意義。傳統(tǒng)的病毒鑒定技術(shù)和研究方法在挖掘新病毒以及新發(fā)傳染性疾病的提前預警方面存在較大的局限性?；诙鷾y序技術(shù)的病毒宏基因組學（VIRALMETAGENOMICS）研究方法直接以樣本中的所有病毒核酸為研究對象能夠檢測出樣品中存在的已知病毒及未知病毒該技術(shù)出現(xiàn)和興起為探索新病毒及診斷新發(fā)病毒性傳染病提供了技術(shù)支持。為了了解和掌握鼠類腸道內(nèi)病毒群落的組成以及挖掘新病毒，本研究運用病毒宏基因組學方法對采自泰州地區(qū)的鼠腸道內(nèi)容物樣品進行研究。本研究主要內(nèi)容和結(jié)果如下一鼠腸道病毒群落的組成結(jié)果顯鼠類腸道病毒群落的組成包括腺病毒科（ADENOVIRIDAE）、指環(huán)病毒科（ANELLOVIRIDAE）、布尼亞病毒科（BUNYAVIRIDAE）、杯狀病毒科（CALICIVIRIDAE）、黃病毒科（FLAVIVIRIDAE）、冠狀病毒科（CONAVIRIDAE）、二順反子病毒科DICISTROVIRIDAE、皰疹病毒科（HERPESVIRIDAE）、人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（HERV）、微小噬菌體科（MICROVIRIDAE）、乳頭瘤病毒科（PAPILLOMAVIRIDAE）、細小病毒科（PARVOVIRIDAE），藻類去氧核糖核苷酸病毒科（PHYCODNAVIRIDAE）、微小RNA病毒科（PICNAVIRIDAE）、痘病毒科（POXVIRIDAE）、逆轉(zhuǎn)錄病毒科（RETROVIRIDAE）、全病毒科（TOTIVIRIDAE）、帚狀病毒科（VIRGAVIRIDAE）、圓環(huán)病毒科CIRCOVIRIDAE、星狀病毒科（ASTROVIRIDAE）及未分科病毒和其他病毒。病毒群落分析提示（1）鼠腸道病毒群落組成中逆轉(zhuǎn)錄病毒科、未分類科病毒、、微小噬菌體科、人類內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒科構(gòu)成了病毒群落的主體，分別占總病毒群落的605％、1042、554、459。（2）TRAT07、TRAT08、TRAT09三個病毒庫存在杯狀病毒科和腺病毒科，且TRAT07庫所含序列較多而TRAT08、TRAT09所含序列較少。（3）病毒文庫含有多種能夠感染哺乳動物的病毒。（二）新病毒的鑒定（1）新型GEMYCIRCULARVIRUS從鼠腸道內(nèi)容物樣品中發(fā)現(xiàn)了新的GEMYCIRCULARVIRUS，該類病毒為新近在人類、多種動物體內(nèi)甚至是環(huán)境樣品發(fā)現(xiàn)的單鏈環(huán)形DNA病毒。目前該病毒是否能夠致病甚至是否能在動物體內(nèi)復制尚無確切定論。為了進一步確認GEMYCIRCULARVIRUS是在老鼠血液樣品內(nèi)存在，本研究根據(jù)鼠糞便樣品發(fā)現(xiàn)的GEMYCIRCULARVIRUSREP基因的核酸序列設計兼并引物，對50份實驗鼠的血液樣品進行檢測，結(jié)果在4份實驗樣品中發(fā)現(xiàn)了該病毒序列并進行測序，基于該361BP的DNA片段分析顯示4條序列的相似度為100。選取其中一份陽性樣品進行鼠GEMYCIRCULARVIRUS的全基因組擴增，結(jié)果顯示鼠GEMYCIRCULARVIRUS全基因組由2188個堿基組成，其基因組含有兩個方向相反的基因分別編碼衣殼蛋白（CAP）及復制蛋白（REP）兩種蛋白。根據(jù)病毒的保守蛋白（REP）的氨基酸序列進行進化分析結(jié)果顯示，該病毒毒株與來自鳥的GEMYCIRCULARVIRUS（KF371635）和蚊子的GEMYCIRCULARVIRUS（KF371635）聚集，同源性分別是487和494，顯示該病毒屬于新的GEMYCIRCULARVIRUS。（2）新型BUFAVIRUS研究中發(fā)現(xiàn)了一株新的BUFAVIRUS命名為RATBUV。該病毒近全基因組序列為4643BP，主要編碼三種蛋白分別是非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1）、衣殼蛋白1VP1以及衣殼蛋白2（VP2）；基于全基因組的進化分析顯示RATBUV與MPULUNGUBUFAVIRUSMPBUV聚集形成了單獨的進化枝。基于NS1、VP1、VP2氨基酸序列分析顯示RATBUV與人BUVS、MPBUV、WUHARV細小病毒的同源性分別是506–772H3–773和471–783。因此，認為RATBUV是細小病毒屬中新的病毒種。對40份鼠腸道內(nèi)容物樣品檢測發(fā)現(xiàn)有5份樣品RATBUV為陽性，陽性率為125。陽性樣品的測序結(jié)果顯示5條核酸序列長為379BP，序列同源性為98說明單一的BUFAVIRUS毒株在這一地區(qū)的鼠群中流行。結(jié)論（1）運用病毒宏基因組學方法掌握了鼠腸道病毒群落組成；（2）鼠腸道病毒群落中病毒種類呈多樣性；（3）從鼠腸道病毒群落內(nèi)發(fā)現(xiàn)了1株新型GEMYCIRCULARVIRUS、1株新型BUFAVIRUS。

簡介：研究目的通過檢測慢病毒介導的Γ谷氨?；然福╒ITAMINKDEPENDENTGAMMAGLUTAMYLCARBOXYLASE，GGCX）基因轉(zhuǎn)染兔骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞后對其凋亡的影響，以及對兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨細胞中MMP13、Ⅱ型膠原和Ⅹ型膠原的影響，探討其對兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的作用。進而為體外骨性關(guān)節(jié)炎的基因治療提供實驗依據(jù)。研究方法1、選取12只重量約20±02KG左右的日本雄性大耳兔，運用膝前交叉韌帶切斷的方法構(gòu)建動物模型。對白兔進行6周飼養(yǎng)后處死，對兔膝關(guān)節(jié)的軟骨細胞進行分離以及培養(yǎng)，最后運用ALCIANBLUE染色法以及Ⅱ型膠原纖維染色法對軟骨細胞做鑒定。2、隨機將軟骨細胞分為三個組空白對照組（不作任何處理）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染不含GGCX慢病毒的空載體）、轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染含GGCX慢病毒）。檢測轉(zhuǎn)染成功后分別用QRTPCR法及WESTERNBLOT法檢測各組中軟骨細胞中GGCX、MMP13、Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原MRNA及蛋白表達水平。3、運用ANNEXINVFITCPI法來檢測各個分組中軟骨細胞的凋亡的情況。4、運用茜素紅染色軟骨細胞進行組織學檢查。研究結(jié)果1、兔骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細胞在初代中顯現(xiàn)為扁平，多角不規(guī)則，有幾個隆突，胞核為橢圓形，位于胞體中間。ALCIANBLUE染色軟骨細胞表現(xiàn)天藍色，Ⅱ型膠原纖維染色發(fā)現(xiàn)軟骨細胞和胞外基質(zhì)表現(xiàn)棕色或黃色。2、QRTPCR檢測結(jié)果示GGCX在轉(zhuǎn)染組中表達水平明顯升高，MMP13在轉(zhuǎn)染組中的表達水平明顯降低，Ⅱ型膠原在轉(zhuǎn)染組中表達明顯升高，X型膠原在轉(zhuǎn)染組中表達水平亦明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜005），陰性對照組以及空白對照組之間相比較未見顯著差異（P＞005）；WB檢測結(jié)果顯示GGCX在轉(zhuǎn)染組中表達水平明顯升高，MMP13在轉(zhuǎn)染組中的表達水平明顯降低，Ⅱ型膠原在轉(zhuǎn)染組中表達水平明顯升高，X型膠原在轉(zhuǎn)染組中表達水平亦明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜005），陰性對照組以及空白對照組之間相比較未見明顯的差異（P＞005）。3、運用ANNEXINVFITCPI法檢測各個分組凋亡率的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組總凋亡率為17833±2612％，與空白對照組總凋亡率（25467±2623）以及陰性對照組總凋亡率（26167±2637）相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜005），陰性對照組以及空白對照組相比較未見明顯差異存在（P＞005）。4、茜素紅染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組中軟骨基質(zhì)深染，細胞數(shù)量多，可見少量鈣結(jié)節(jié)，空白組和陰性對照組中軟骨基質(zhì)染色均一，大量鈣結(jié)節(jié)形成。結(jié)論1、采取前叉韌帶切斷大白兔的韌帶能夠成功造出白兔骨關(guān)節(jié)炎的模型，并能夠成功分離培養(yǎng)出兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨細胞；2、慢病毒能成功介導GGCX基因轉(zhuǎn)染兔骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細胞使其表達顯著增加；3、轉(zhuǎn)染含GGCX慢病毒能夠使軟骨細胞Ⅱ型膠原的表達顯著增加；4、轉(zhuǎn)染含GGCX慢病毒能夠使軟骨細胞MMP13、X型膠原的表達顯著降低；5、轉(zhuǎn)染含GGCX慢病毒后能夠使骨性關(guān)節(jié)炎中軟骨細胞的凋亡受到顯著抑制；6、轉(zhuǎn)染含GGCX慢病毒后能夠使骨性關(guān)節(jié)炎鈣結(jié)節(jié)形成受到顯著抑制。

簡介：目的體外篩選設計并合成的抑制效率最佳的MMP3SHRNA慢病毒載體，并觀察其對人退變髓核細胞的生物學效應。方法采用酶序貫消化法對臨床腰椎間盤突出癥患者需行摘除術(shù)來源的髓核組織進行分離、單層原代細胞培養(yǎng)，應用細胞免疫組化法、細胞免疫熒光法等方法對髓核細胞進行鑒定；根據(jù)人MMP3基因MRNA序列設計合成4對不同的MMP3SHRNA序列，與酶切后LV3載體鏈接并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞，通過PCR和基因測序?qū)U增的陽性克隆進行鑒定，對慢病毒進行包裝和滴度測定；通過熒光定量PCR、WESTERNBLOT分別檢測轉(zhuǎn)染人退變髓核細胞后MMP3、Ⅱ型膠原、蛋白多糖基因和蛋白質(zhì)水平的變化，從而篩選最佳抑制序列慢病毒載體及其對人退變髓核細胞的生物學效應。結(jié)果原代髓核細胞呈三角形、多角形或短梭形等不規(guī)則形狀，細胞核較大，培養(yǎng)約3周時，原代髓核細胞匯合可達80％以上；蘇木精伊紅染色細胞核呈藍色，胞漿呈淡紅色，甲苯胺藍染色胞核成深藍色，胞漿呈淡藍色，細胞免疫組化及細胞免疫熒光Ⅱ型膠原分別呈黃褐色和綠色熒光。經(jīng)酶切鑒定陽性擴增片段正確，基因測序顯示與設計序列完全相符，滴度檢測顯示大于1X108TUML。MMP3SHRNA慢病毒轉(zhuǎn)染72和96小時后從MMP3基因和蛋白水平綜合篩選得出MMP3SHRNA3為最佳抑制序列（P結(jié)論成功構(gòu)建并篩選出抑制效率最佳的MMP3SHRNA慢病毒載體；慢病毒介導的RNAI可以顯著抑制人退變髓核細胞MMP3的表達，從而增加人退變髓核細胞外基質(zhì)表達量，有望成為阻止或逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的進程而治療椎間盤退變。

簡介：手足口?。℉FOOTMOUTHDISEASEHFMD）是一種由人類腸道病毒（HUMANENTEROVIRUSHEV）感染引起的疾病，好發(fā)于嬰幼兒，能夠引發(fā)廣泛的臨床癥狀，如發(fā)燒、口腔皰疹、四肢遠端皮疹等。通常，手足口病癥狀輕微，1014天可自行消退，少數(shù)情況下會導致嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，甚至造成死亡。我國衛(wèi)生部于2008年5月2日將其納入傳染病防治法規(guī)定的丙類傳染病進行管理。近年來，手足口病一直是發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)最高的丙類傳染病病種。引起HFMD的主要病原體為人類腸道病毒71型（HUMANENTEROVIRUS71EV71）和柯薩奇病毒A組16型（COXSACKIEVIRUSA16COXA16），通常COXA16引起的手足口病癥狀較輕，而EV71更易導致神經(jīng)系統(tǒng)感染威脅兒童生命。EV71屬于小RNA病毒科，VP1作為其主要的衣殼蛋白，在EV71對宿主細胞的吸附和穿入過程中起重要作用；同時，VP1上存在特異性中和性抗原表位，是EV71最主要的抗原決定簇，在EV71疫苗的研究中十分重要。本研究對河南省信陽地區(qū)2014年6月到2015年12月收集到的HFMD病例進行病原學檢測及流行病學分析。我們收集了46份HFMD患兒的糞便樣本，提取病毒RNA，分別用EV71VP1通用型引物和COXA16VP1通用型引物進行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（REVERSETRANIONPOLYMERASECHAINREACTIONRTPCR）擴增，并對產(chǎn)物進行測序，結(jié)果顯示46份樣本中EV71陽性16例，COXA16陽性14例。對測序結(jié)果進行序列分析比對，確定分離到的EV71均屬于C4A亞型，與歷年河南地區(qū)分離得到的毒株序列比較未見明顯差異；與吉林、廣東以及廣西地區(qū)分離的毒株相比較同樣沒有明顯差異，提示樣本中分離得到的EV71毒株無南北地域差別；同時與2008年安徽阜陽EV71流行株VP1序列比對亦未見明顯差異，提示為國內(nèi)循環(huán)流行株。通過CLUSTALX軟件對本研究中分離到的8株病毒的VP1區(qū)與C基因型毒株VP1區(qū)進行比對，結(jié)果顯示核苷酸同源性為855％～966；與ABRCRUSA70原型株VP1區(qū)進行比對，結(jié)果顯示核苷酸同源性為824～83；與BMS嗜神經(jīng)毒株VP1區(qū)進行比對，結(jié)果顯示核苷酸同源性為837～851，提示本次分離到的毒株與上述原型株和嗜神經(jīng)毒株親緣關(guān)系較遠。在流行病學調(diào)查方面，我們分析了上述46名患兒發(fā)病的時間、臨床癥狀、年齡、性別、居住地。結(jié)果顯示本次收集到的病例2014年6月和7月及2015年11月和12月病例較多，均為輕癥臨床上難以分辨其病原；4歲以下患兒占到83；男女比例為121；居住地在農(nóng)村與城市比例為411。提示在信陽地區(qū)手足口病發(fā)病季節(jié)可能有兩個高峰期，對手足口病病原的鑒定有賴于在實驗室進行的分子生物學檢測，4歲以下幼兒尤其是男孩感染的可能性更高，農(nóng)村比城市具有更高的危險性。研制EV71和COXA16的預防疫苗是防治手足口病暴發(fā)的主要手段之一。在重組多價腸道病毒疫苗研究方面，我們將脊髓灰質(zhì)炎病毒（POLIOVIRUS）的減毒株SABIN1全長分四個片段進行克隆并構(gòu)建到了PMD18T載體上，繼而構(gòu)建了EV71VP1和COXA16VP1的真核表達質(zhì)粒PCFLAGEV71VP1和PCFLAGCA16VP1并在轉(zhuǎn)染后的細胞中檢測到VP1融合蛋白的表達，為后續(xù)以SABIN1為載體構(gòu)建EV71和COXA16疫苗的研究打下了良好的基礎(chǔ)。本研究對于手足口病病原研究及分子流行病學調(diào)查將有助于理解該病的傳播，為信陽地區(qū)手足口病的防治提供了理論依據(jù)；對重組多價腸道病毒疫苗的研究為研發(fā)手足口病疫苗提供了新思路。

簡介：重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文1英漢縮略語名詞對照英漢縮略語名詞對照英文縮寫英文縮寫英文全稱英文全稱中文全稱中文全稱ADVADENOVIRUS腺病毒CDHR3CADHERINRELATEDFAMILYMEMBER3鈣粘蛋白相關(guān)家族成員3DNADEOXYRIBONUCLEICACID脫氧核糖核酸EBETHIDIUMBROMIDE溴化乙錠HBOVHUMANBOCAVIRUS人博卡病毒HCOVHUMANCORONAVIRUS人冠狀病毒HEVHUMANENTEROVIRUS人腸道病毒HMPVHUMANMETAPNEUMOVIRUS人偏肺病毒HRVHUMANRHINOVIRUS人鼻病毒ICAM1INTERCELLULARADHESIONMOLECULE1細胞間粘附分子1IFNINTERFERON干擾素IFVINFLUENZAVIRUS流感病毒ILINTERLEUKIN白細胞介素LDLRLOWDENSITYLIPOPROTEINRECEPTOR低密度脂蛋白受體MLMILLILITER毫升NCRNONCODINGREGION非編碼區(qū)NPANASOPHARYNGEALASPIRATE鼻咽抽吸物NPCRNESTPOLYMERASECHAINREACTION巢式聚合酶鏈反應NPSNASOPHARYNGEALSWABS咽拭子PCRPOLYMERASECHAINREACTION聚合酶鏈反應PIVPARAINFLUENZAVIRUS副流感病毒QPCRQUANTITATIVEPOLYMERASECHAINREACTION熒光定量聚合酶鏈反應RNARIBONUCLEICACID核糖核酸RSVRESPIRATORYSYNCYTIALVIRUS呼吸道合胞病毒RTREVERSETRANSCRIPTION逆轉(zhuǎn)錄ΜLMICROLITRE微升

簡介：重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文1英漢縮略名詞對照英漢縮略名詞對照英文縮寫英文縮寫英文全稱英文全稱中文全稱中文全稱CDNACOMPLEMENTARYDEOXYRIBONUCLEICACID互補脫氧核糖核酸DNADEOXYRIBONUCLEICACID脫氧核糖核酸PBSPHOSPHATEBUFFEREDSALINE磷酸鹽緩沖液PCRPOLYMERASECHAINREACTION聚合酶鏈式反應RNARIBONUCLEICACID核糖核酸RRNARIBOSOMALRNA核糖體核糖核酸RTPCRREVERSETRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTION逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應℃CENTIGRADE攝氏度RVROTAVIRUS輪狀病毒DNTPDEOXYNUCLEICACID脫氧核糖核苷三磷酸DEPCDIETHYLPYROCARBONATE焦碳酸二乙酯TAQTHERMUSAQUATICUSDNA耐熱DNA聚合酶

簡介：目的以四種不同方案治療輪狀病毒腸炎，對其臨床效果以及經(jīng)濟學效益進行綜合分析，比較病癥緩解效果，為臨床治療提供參考依據(jù)。方法抽取2013年9月2015年9月所有輪狀病毒感染引起的小兒腸炎患兒398例作為研究對象，全部病例均符合兒科學第八版輪狀病毒腸炎診斷標準，所有患兒均留取大便樣本，均為輪狀病毒（RV）抗原陽性，明確診斷為RE。依據(jù)數(shù)字表法將其隨機分為A組、B組、C組以及D組，A組87例，B組102例，C組93例，D組116例。A組給予補充電解質(zhì)、糾正脫水及酸堿平衡紊亂、口服益生菌及胃腸粘膜保護劑等常規(guī)治療，B組在A組的治療基礎(chǔ)上合并應用干擾素Α1B；C組在B組治療基礎(chǔ)上給予無乳糖奶粉喂養(yǎng)；D組在C組治療基礎(chǔ)上給予葡萄糖酸鋅片治療。治療前查血氣分析、電解質(zhì)，治療前后均采用ELISA進行了大便輪狀病毒抗原、腫瘤壞死因子TNF的檢測，并對患者的臨床病癥改善情況進行評估。治療后每2D、3D、4D分別取患者大便樣本進行一次輪狀病毒的檢測，待其轉(zhuǎn)為陰性后即可結(jié)束檢測。分析影響患者大便排毒的因素，并采用回顧性分析探討其最主要的影響因素。比較四種治療方式的總療效，并對其進行成本效益分析。結(jié)果1、治療前四組患者的癥狀評分經(jīng)組間兩兩比較均無顯著差異，不具備統(tǒng)計學意義（P＞005），治療后四組之間兩兩相比差異顯著，兩組比較具有統(tǒng)計學意義（P＜005）。2、治療后D組與C組的嘔吐、發(fā)熱延續(xù)時間比較無顯著差異，組間比較不具備統(tǒng)計學意義（P＞005），D組腹瀉延續(xù)時間明顯短于B組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜005）；C組的嘔吐、發(fā)熱病癥延續(xù)時間均短于B組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜005），兩組的腹瀉延續(xù)時間并無顯著差異，不具備統(tǒng)計學意義（P＞005）；D組的嘔吐、發(fā)熱以及腹瀉延續(xù)時間均顯著短于B組以及A組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜005）；BCD組的病癥延續(xù)時間均短于A組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜005）。3、治療前，四組患者的腫瘤壞死因子TNF均無顯著差異，組間比較不具備統(tǒng)計學意義（P＞005）；治療后四組患者的腫瘤壞死因子TNF差異顯著，組間兩兩比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜005）。4、四組患者在治療后的2D大便輪狀病毒的轉(zhuǎn)陰情況并無顯著差異，組間比較不具備統(tǒng)計學意義（P＞005）；治療3D后D組的轉(zhuǎn)陰率高于B組與A組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜005），其他兩兩比較均無顯著差異，不具備統(tǒng)計學意義（P＞005）；治療4D后，組間兩兩相比差異顯著，具有統(tǒng)計學意義（P＜005）。5、四組患者在不同的治療措施下均會出現(xiàn)不同程度的不良反應，各種單一的不良反應組間比較均無顯著差異，不具備統(tǒng)計學意義（P＞005）；然而總不良反應比較可知，D組的總不良反應發(fā)生率150％明顯低于C組的258、B組的294以及A組的292，組間比較差異顯著，具有統(tǒng)計學意義（P＜005）；其他組間比較均無顯著差異，組間比較不具備統(tǒng)計學意義（P＞005）。6、D組患者的治療總有效率958明顯高于B組以及A組的883，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜005）；D組患者的治療總有效率958高于C組的942，C組則高于B組的883，然而組間比較差異不顯著，不具備統(tǒng)計學意義（P＞005）。7、本次實驗將四組患者治療期間的總有效率以及花銷進行了成本效益分析，結(jié)果D組的成本效益最低，為6882，其增量成本效益也較B組以及A組更低。假定本次實驗中的總護理費用以及治療費用調(diào)高了12，藥品總價格調(diào)低了15，同時檢查費用調(diào)高了6，此時對上述成本效益進行再次分析。結(jié)果可知D組的成本效益以及增量成本效益依舊最低，分別為7062，11125。可見D組的用藥治療方案具有較高的敏感性。結(jié)論1、臨床通過四種不同的治療方案治療輪狀病毒腸炎，D組治療方案不僅具有較好的病癥緩解效果，且不良反應發(fā)生率低，具有一定的安全性，可達到較好的輪狀病毒轉(zhuǎn)陰率，可為臨床治療提供參考。2、合理的藥物配置以及資源配置可以最小的成本獲得最大的綜合效益，還能大大降低患者的經(jīng)濟負擔，本次實驗研究結(jié)果證明，D組治療方案的成本效益優(yōu)于C組，C組優(yōu)于A、B兩組，臨床可推薦患者采用無乳糖奶粉聯(lián)合干擾素Α1B及葡萄糖酸鋅片的治療方案獲得更好的綜合效果。

簡介：目的了解郴州地區(qū)臨床患者和吸毒人群HCV（丙型肝炎病毒）抗體陽性患者HCV感染狀況，基因型分布及其變化特點。方法1收集臨床患者和吸毒人群患者血樣，采用ELISA（酶聯(lián)免疫反應）檢測抗HCV抗體，HBSAG（乙肝表面抗原）和HDVIGG丁型肝炎病毒抗體；2采用巢式RTPCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應）檢測HDV核酸和擴增HCV5UTRC區(qū)和NS5B區(qū)，將HCV陽性產(chǎn)物送測序公司；3采用REALTIMEPCR實時定量PCR檢測不同人群血清HCVRNA；4運用MEGA52軟件對HCV5UTRC區(qū)段和NS5B區(qū)段基因序列進行比對和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析。結(jié)果1臨床患者和吸毒人群HCV抗體陽性患者HCV核酸陽性率分別為646％和811，其中HCV單感染率分別為520和710，HCVHBV共感染率均為56，HCVHBVHDV共感染率分別為08和22。2臨床患者HCV感染者1B型27例（329），2A型8例（98），3型19例（232），6A型22例（268）；吸毒人群中1B型8例（37），2A型8例（37），3A型70例（32），6A型129例（592）。通過進化樹分析發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)HCV1B型序列分散在廣州株和廣西株附近，2A型序列分布靠近湖北株，而6A型與參考序列分布比較分散。3不同人群總體及其各基因型的HCVRNA水平具有統(tǒng)計學意義。臨床患者6A型HCVRNA水平明顯高于3型，吸毒人群6A型HCVRNA水平明顯高于3型和2A型，3型和1B型HCVRNA水平明顯高于2A型，且差異均具有統(tǒng)計學意義（P值均＜005），而且HCV單感染患者HCVRNA水平明顯高于HCVHBV共感染者，且差異均具有統(tǒng)計學意義（P值均＜005）。4不同人群總體及其各基因型的ALT和AST水平無統(tǒng)計學差異，HCV單感染患者ALT和AST水平與HCVHBV共感染患者差異無統(tǒng)計學意義（P值均＞005）。5通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)不同人群HCVRNA水平與ALT和AST水平無相關(guān)性。結(jié)論1臨床患者HCV基因型主要以1B為主，而吸毒人群以6A為主。2臨床患者病毒載量高于吸毒人群，而且在兩組人群中HBV和HCV共感染中病毒復制水平不平衡。

簡介：分類號R37325UDC密級重慶醫(yī)科大學碩士學位論文論文題目20152015年重慶地區(qū)兒童諾如病毒性胃腸炎分子流行病學年重慶地區(qū)兒童諾如病毒性胃腸炎分子流行病學研究研究作者姓名陳岑陳岑申請學位級別碩士學科、專業(yè)名稱兒科學（感染消化）兒科學（感染消化）論文答辯年月2016年5月2016年5月指導教師姓名（職稱、單位名稱）許紅梅許紅梅教授教授重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院重慶市渝中區(qū)中山二路重慶市渝中區(qū)中山二路136136號（號（400014400014）目錄英漢縮略語名詞對照英漢縮略語名詞對照1中文摘要中文摘要2英文摘要英文摘要4論文正文論文正文2015年重慶地區(qū)兒童諾如病毒性胃腸炎分子流行病學研究年重慶地區(qū)兒童諾如病毒性胃腸炎分子流行病學研究6前言前言61標本來源、實驗材料與方法標本來源、實驗材料與方法711標本來源標本來源712實驗材料實驗材料7121實驗儀器實驗儀器7122主要實驗試劑主要實驗試劑813實驗步驟實驗步驟8131實驗前準備實驗前準備8132標本預處理標本預處理8133RNA提取提取9134RNA逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄9135NOVRTPCR10136NOVRTPCR產(chǎn)物鑒定產(chǎn)物鑒定12137NOV基因測序與分析基因測序與分析12138NOV重組分析重組分析1314統(tǒng)計學分析統(tǒng)計學分析152結(jié)果結(jié)果1521NOV檢出情況檢出情況1522NOV基因型分析基因型分析1823NOV重組分析重組分析203討論討論23結(jié)論結(jié)論25

簡介：本文通過以下幾個部分展開論述第一部分我國部分地區(qū)艾滋病抗病毒治療效果評價自我國于2003年實施“四免一關(guān)懷”政策，為HIV感染者開展免費抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療ANTIRETROVIRALTHERAPY，ART以來，截至2013年底已有超過278萬例患者接受了一線藥物的治療。所有符合條件的感染者均可接受治療，而高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療HIGHLYACTIVEANTIRETROVIRALTHERAPY，HAART已覆蓋了我國31個省、市、自治區(qū)。既往針對HAART效果的研究往往局限于短期內(nèi)的觀察以及較小的樣本量，而評價治療效果亟需長期大樣本的研究。目的根據(jù)患者的病毒載量VIRALLOAD，VL和CD4T淋巴細胞計數(shù)來分析治療的效果，評判病毒學失敗和免疫學失敗的發(fā)生情況并分析相關(guān)的危險因素，為治療策略的制訂和完善提供依據(jù)。方法回顧性收集國家“艾滋病綜合防治信息系統(tǒng)抗病毒治療管理”數(shù)據(jù)庫中符合條件的患者數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)收集的截止時間為2014年1月。觀察終點為患者發(fā)生病毒學失敗和免疫學失敗。利用KAPLANMEIER曲線分析治療失敗的發(fā)生情況，利用COX風險比例模型分析與治療失敗相關(guān)的危險因素。結(jié)果共有2172名患者納入本研究，中位年齡為33歲，785％的患者為男性，482％通過異性性行為感染。中位隨訪時間為31個月，63名29％患者死于AIDS相關(guān)疾病，發(fā)生病毒學失敗和免疫學失敗的分別有292人134％和400人184％COX模型分析結(jié)果顯示，與各自的對照組相比，經(jīng)由IDU感染AHR，ADJUSTHAZARDRATIO209，95％CI105417，基線VL大于106拷貝MLAHR219，95％CI125384，以及基線臨床分期為Ⅳ期AHR461，95％CI2011057是發(fā)生病毒學失敗的相關(guān)因素，基線年齡在50歲以上AHR142，95％CI101202，以及基線臨床分期為ⅢAHR169，95％CI107269或Ⅳ期AHR215，95％CI138334相對于各自對照組為發(fā)生免疫學失敗的危險因素，而基線CD4T細胞計數(shù)在50個ΜL至99個ΜL之間AHR046，95％CI032066和100個ΜL至199個ΜL之間AHR053，95％CI041070相比于基線CD4計數(shù)在50個ΜL以下則是發(fā)生免疫學失敗的保護因素。結(jié)論從治療效果來看，患者的死亡率保持在較低的水平，病毒學和免疫學指標也得到了較好的控制，患者基線時的身體狀況與治療失敗的發(fā)生有較強關(guān)聯(lián)，提示在今后的工作中應盡早將感染者納入治療。第二部分抗病毒治療對男男性行為人群艾滋病疫情影響的動力學模型研究性行為已成為我國艾滋病傳播的主要途徑，而其中經(jīng)同性性行為感染的比例正逐年增加，針對男男性行為人群MENWHOHAVESEXWITHMEN，MSM的艾滋病疫情變化，已有一些學者利用動力學模型做了理論性研究，但鮮有文獻在模型中考慮耐藥對整體疫情的影響。因此，有必要針對MSM的高危行為和治療情況進行綜合分析，以了解疫情可能的發(fā)展趨勢及影響因素。目的估計我國MSM人群中艾滋病疫情的變化趨勢，分析不同防治措施、同一措施的不同水平對疫情可能產(chǎn)生的影響，為艾滋病防治工作提供參考依據(jù)。方法采用確定性動力學模型對MSM人群中的艾滋病流行情況進行模擬，模型參數(shù)主要來源于既往相關(guān)研究和文獻。主要分析感染者總?cè)藬?shù)、AIDS期人數(shù)、耐藥者人數(shù)及其在感染者中的比例變化趨勢。數(shù)值的模擬分析和圖形繪制分別使用MATLAB2009A和MICROSOFTEXCEL2013完成。結(jié)果MSM人群的艾滋病疫情總體上呈持續(xù)上升趨勢。根據(jù)模型擬合結(jié)果，2015年時總感染人數(shù)為171106人，至2020年總感染人數(shù)約為322106人AID病人數(shù)在2015年時為259105人，至2020年時約為630105人。總耐藥比例和原發(fā)性耐藥比例持續(xù)上升，在2020年時分別達到358％和253％。改變各項參數(shù)條件后的模擬結(jié)果顯示，提高干預措施力度、擴大治療覆蓋和降低患者退出治療率對疫情可以起到一定的抑制作用，而降低耐藥發(fā)生率和退出治療率則能夠控制耐藥者在總感染者中的比例。結(jié)論我國MSM人群的艾滋病疫情仍然嚴峻，在今后的工作中，應加強對高危人群的干預力度，并擴大抗病毒治療的覆蓋范圍，提高患者的治療依從性，以控制疫情的進一步發(fā)展。

簡介：流行性感冒病毒屬正粘病毒科，流感病毒屬，是導致人和多種哺乳類動物以及多種禽類發(fā)生上呼吸道感染的主要病原體。根據(jù)流感病毒內(nèi)部核蛋白NP和基質(zhì)蛋白MP的差異，流感病毒可分為A型、B型和C型三種生物學類型，即甲型、乙型和丙型流感病毒。其中甲型流感病毒是導致流感大流行的主要病毒型，乙型流感病毒主要引起流感的小規(guī)模流行，丙型流感病毒很少引起流感流行，因此目前的流感監(jiān)測網(wǎng)絡主要監(jiān)測的為甲型和乙型流感病毒的變化；其中，甲型流行性感冒病毒感染區(qū)間范圍最大，并可通過抗原漂移及抗原轉(zhuǎn)換等多種變異形式逃逸宿主免疫，從而造成流感大規(guī)模的暴發(fā)流行甚至全球性暴發(fā)流行，因此危害程度最大。甲型流感病毒根據(jù)其包膜表面兩種主要抗原即血凝素HEMAGGLUTININHA和神經(jīng)氨酸酶NEURAMINIDASENA結(jié)構(gòu)和基因特性的不同又可劃分為H1H16、N1N9等若干流感亞型。目前造成大規(guī)模流行的主要類型為為季節(jié)性H1N1、季節(jié)性H3N2和新甲型H1N1甲流流感亞型，隨著近年來檢測技術(shù)發(fā)展和嚴格監(jiān)測，諸如H7N9、H5N3等禽流感病毒感染人病例逐漸增多，禽流感已經(jīng)成為社會關(guān)注的焦點之一。目的對20092015年間山東省日照區(qū)域國家流感監(jiān)測哨點醫(yī)院日照市人民醫(yī)院收集的流感樣病例INFLUENZALIKEILLNESSILI鼻咽拭子標本開展流感病毒的核酸檢測和病毒分離，旨在明確日照市流感病毒流行及變異情況。方法本研究收集2009年2015年流感樣病例咽拭子標本，采用狗腎細胞系MDCK進行流感病毒分離；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應REVERSETRANIONPOLYMERASECHAINREACTIONRTPCR特異性擴增20142015年度流行的甲型H3N2流感病毒分離到的甲型流感病毒H3N2毒株的HA及NA基因組序列，進行序列測定。通過MEGA50軟件對流感分離毒株基因序列進行分析，觀察日照地區(qū)甲型流感病毒進化規(guī)律及分子變異特點；并對日照地區(qū)20142015年度流感病毒監(jiān)測分離到的流感病毒毒株序列、流感樣爆發(fā)病例分離到的毒株序列以及2013年度H3N2病毒毒株序列進行比對，同時與世界衛(wèi)生組織WHO推薦的20142015年度的疫苗毒株進行比對，對流感疫苗在日照地區(qū)的應用情況進行分析和評估。結(jié)果①日照市地區(qū)流感病毒的流行毒株大體上為交替流行的狀態(tài)，流行狀態(tài)主要表現(xiàn)為一種型別毒株呈絕對優(yōu)勢或者幾型流感病毒同時流行，除2014年日照地區(qū)流感流行中三種流感病毒甲型H1N1，甲型H3N2，B型流感病毒所占比例基本相同外，其余幾年均為一型流感病毒呈絕對的優(yōu)勢流行狀態(tài)。②通過對日照地區(qū)流行的甲型H3N2流感病毒HA及NA片段的基因比對分析，發(fā)現(xiàn)日照地區(qū)的甲型H3N2流感病毒在流行過程中存在著變異的現(xiàn)象，其中通過聚集性病例和普通病例的病毒分離株比對發(fā)現(xiàn)，聚集性病例的病毒株與普通病例的病毒株在基因樹上有明顯的不同，分為不同的分支。結(jié)論①日照地區(qū)流感流行毒株類型與山東省其它地區(qū)大體一致，流行時間一般晚于全省進入流感流行季，2014年度較往年提前，因此流感的防控既在參考大流行數(shù)據(jù)的同時必須結(jié)合當?shù)氐牧餍刑攸c，并做好流感因變異引起的異常流行的準備。②同型別的流感病毒在一季的流行過程中存在著進化的現(xiàn)象，即上半年的毒株和下半年分離到的流感毒株在基因進化樹上明顯的分為兩簇，而且在平行的流行季節(jié)過程中，流感病毒能夠發(fā)生部分變異，使得該病毒能夠逃避人群中已有的免疫力，因而造成聚集性流感樣病例的產(chǎn)生，因此加強流感監(jiān)測，加強流感病毒變異的檢測對預防流感的流行具有重要意義。

簡介：點擊查看更多山豆根主要活性成分的保肝抗病毒作用及免疫學機制研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡介：目的通過慢病毒介導MMP3SHRNA和FASSIRNA雙基因體外轉(zhuǎn)染人退變髓核細胞，探討單基因、雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染后對人退變髓核細胞功能的影響。方法A體外培養(yǎng)人退變髓核細胞，對其進行臺盼藍染色、甲苯胺藍染色，觀察細胞活力以及細胞形態(tài)；B分別根據(jù)人MMP3基因與FAS基因的MRNA序列合成不同的MMP3SHRNA與FASSIRNA序列，與酶切后的慢載體鏈接并轉(zhuǎn)入感受態(tài)293T細胞，對慢病毒進行包裝。C慢病毒感染退變髓核細胞，按照處理方式不同，本實驗分為5組，分別為A空白對照組，BAAV陰性對照組，CAAVMMP3SHRNA組，DAAVFASSIRNA組，EAAVFASSIRNAMMP3SHRNA組；D轉(zhuǎn)染72小時后CCK8測定各組之間的細胞增殖情況；72小時通過熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染髓核細胞MRNA水平變化MMP3、FAS以及Ⅱ型膠原、蛋白多糖；96小時后通過WESTERNBLOT檢測髓核細胞內(nèi)蛋白水平變化（Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖）。結(jié)果A細胞形態(tài)學進行觀察發(fā)現(xiàn)初消化的成人退變髓核細胞貼壁時間約為45天，初貼壁時的形態(tài)表現(xiàn)為橢圓形、梭形、多角形，形狀不規(guī)則，胞質(zhì)向外伸突并隨著時間延長逐漸伸長。經(jīng)1014D以后，90細胞呈融合狀態(tài)，形狀類似漩渦狀或火焰狀的細胞團，胞質(zhì)豐富且?guī)в幸欢ㄕ酃庑?，細胞核較大輪廓清楚，呈卵圓形核，有大約13個核仁。經(jīng)過傳代后，第一代細胞之間的粘附性較原代變差，細胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形，這與之前的研究相一致原代髓核細胞經(jīng)甲苯胺藍染色后呈短梭形、多角形等不規(guī)則形狀，胞質(zhì)均呈藍色，細胞核位于細胞中央或偏向一側(cè)細胞膜，顏色較周圍胞質(zhì)深。B退變髓核細胞原代培養(yǎng)期間存活率在97以上，第1代培養(yǎng)期間存活率在9296之間，第二代仍能維持90左右以后細胞存活率逐漸下降。C72小時后用熒光顯微鏡檢測重組慢病毒侵染人退變髓核細胞后的GFP、BFP表達情況，結(jié)果顯示各組退變髓核細胞均已達到很高的轉(zhuǎn)染效果。D與空白對照組相比較，F(xiàn)AS干擾組、MMP3干擾組及MMP3FAS雙基因共轉(zhuǎn)組FAS、MMP3、II型膠原、蛋白多糖的MRNA表達量增加，且雙基因組效果優(yōu)于單基因組，與空白對照組相比較，F(xiàn)AS干擾組、MMP3干擾組及MMP3FAS雙基因共轉(zhuǎn)組髓核細胞的蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白表達量增高，且雙基因組效果優(yōu)于單基因組，以上結(jié)果差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜005）。結(jié)論1通過基因沉默技術(shù)干擾髓核細胞內(nèi)FAS、MMP3基因的表達，可以有效抑制髓核細胞的凋亡，雙基因共轉(zhuǎn)染具有協(xié)同作用。2慢病毒介導的RNAI可以顯著抑制人退變髓核細胞MMP3、FAS的表達，增加人退變髓核細胞外基質(zhì)表達量，且雙基因具有協(xié)同效應。

簡介：【研究背景】漢灘病毒（HANTAANVIRUSHTNV）感染在我國主要引起腎綜合征出血熱（HEMRHAGICFEVERWITHRENALSYNDROMEHFRS），該病缺乏特異有效的治療藥物，通過疫苗接種預防HTNV感染成為控制疾病發(fā)生的主要手段。病毒樣顆粒（VIRUSLIKEPARTICLEVLP）是病毒生活周期中結(jié)構(gòu)蛋白自我組裝形成的不含病毒核酸的顆粒樣物質(zhì)，包括HTNV在內(nèi)的部分病毒，能夠通過基因工程方法表達病毒結(jié)構(gòu)蛋白合成VLP，VLP作為疫苗具有安全性高、免疫效果好的優(yōu)點。在VLP表面嵌合粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GRANULOCYTEMACROPHAGECOLONYSTIMULATINGFACTGMCSF）或CD40配體（CD40LIGCD40L）的免疫佐劑可提高其免疫效果。本實驗室前期在哺乳動物細胞中成功表達了含有HTNV核衣殼蛋白（NUCLEOPROTEINNP）和包膜糖蛋白（GLYCOPROTEINGP）的HTNVVLP，并在此基礎(chǔ)上嵌合佐劑基因表達出HTNVVLPGMCSF和HTNVVLPCD40L。本研究旨在明確HTNV嵌合VLPS的生物學活性，并對其分別免疫小鼠后的長效免疫效果進行初步探討，為HTNVVLP疫苗的應用提供一定的實驗基礎(chǔ)?！狙芯糠椒ā咳NHTNVVLPS（后文分別用VLP代表單純HTNVVLP，VLPGMCSF代表嵌合GMCSF的HTNVVLP，VLPCD40L代表嵌合CD40L的HTNVVLP）分別與無菌分離的C57BL6小鼠骨髓細胞共培養(yǎng)，設置空白對照組，流式細胞術(shù)（FLOWCYTOMETRYFCM）檢測骨髓細胞中F480CD11B細胞、CD11C細胞的數(shù)量以及MHCⅡ、CD40、CD86分子的表達情況，以評價HTNVVLPS促進骨髓細胞向抗原提呈細胞（ANTIGENPRESENTINGCELLAPC）分化、成熟情況。經(jīng)三種HTNVVLPS分別刺激的體外脾臟淋巴細胞中，以及經(jīng)其分別免疫小鼠后分離的脾臟淋巴細胞中，分別檢測CD4CD25細胞和CD8CD25細胞的數(shù)量以測定T細胞增殖和活化情況，檢測B220CD69細胞數(shù)量以測定B細胞增殖和活化情況。三種HTNVVLPS以及HTNV滅活疫苗分別免疫C57BL6小鼠，設置生理鹽水對照組，初次免疫6個月后，以相同劑量加強免疫一次，檢測各實驗組加強免疫前、后的體液免疫和細胞免疫效果，初步評價HTNVVLPS的長效免疫效果。間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ENZYMELINKEDIMMUNOABSDENTASSAYELISA）檢測抗HTNV特異性抗體水平，微量細胞中和實驗檢測抗HTNV中和抗體水平來評價各實驗組的長效體液免疫效果；酶聯(lián)免疫斑點實驗（ENZYMELINKEDIMMUNOSPOTASSAYELISPOT）測定細胞因子IFNΓ和IL4分泌水平，細胞毒性T淋巴細胞（CYTOTOXICTLYMPHOCYTE，CTL）殺傷實驗評價其長效細胞免疫效果；加強免疫前、后，分別用HTNV攻擊免疫小鼠，通過雙抗體夾心ELISA法檢測病毒抗原、實時定量聚合酶鏈反應REALTIMEQUANTITATIVEPOLYMERASECHAINREACTIONRTQPCR檢測病毒核酸、病理切片觀察實驗小鼠臟器病理變化來評價其長效免疫后的動物保護作用。【實驗結(jié)果】FCM檢測結(jié)果顯示，三種HTNVVLPS分別刺激的小鼠骨髓細胞F480CD11B細胞、CD11C細胞數(shù)量以及MHCⅡ、CD40和CD86分子表達水平均明顯升高，表明其有效地刺激了小鼠骨髓細胞向APC分化、成熟。三種HTNVVLPS體外分別刺激的小鼠脾臟淋巴細胞和經(jīng)其免疫后小鼠的脾臟淋巴細胞中CD4CD25、CD8CD25T細胞數(shù)量和B220CD69B細胞數(shù)量均明顯增高，表明HTNVVLPS均有效地促進小鼠體內(nèi)及體外T、B淋巴細胞增殖和活化。其中，VLPGMCSF在促進骨髓細胞向APC分化成熟方面和促進小鼠體內(nèi)、外T細胞增殖和活化方面作用更為明顯。而在促進小鼠體內(nèi)、外B淋巴細胞增殖和活化方面，VLPCD40L的作用更為明顯。長效體液免疫結(jié)果顯示，HTNV滅活疫苗組小鼠血清中幾乎未檢測到抗HTNVNP特異性抗體，且僅檢測到少量的中和抗體。HTNVVLPS分別免疫的小鼠血清中抗HTNVNP特異性抗體和中和抗體水平均高于HTNV滅活疫苗組，VLPGMCSF和VLPCD40L組小鼠抗HTNVNP特異性抗體與中和抗體水平高于VLP免疫組小鼠。加強免疫后，小鼠抗HTNVNP特異性抗體與中和抗體水平均比加強免疫前有所提高。長效細胞免疫結(jié)果顯示，HTNV滅活疫苗組和生理鹽水對照組相比，IFNΓ分泌水平相當，而三種HTNVVLPS分別免疫小鼠后，脾細胞IFNΓ分泌水平明顯高于HTNV滅活疫苗組。加強免疫后，各實驗組小鼠脾細胞IFNΓ分泌水平均高于加強免疫前的水平，而且VLPGMCSF和VLPCD40L免疫組小鼠脾細胞IFNΓ分泌水平明顯高于VLP免疫組。但各實驗組小鼠脾細胞IL4分泌水平均與生理鹽水對照組分泌水平相當。各實驗組小鼠CTL殺傷結(jié)果差異和脾細胞分泌的IFNΓ變化相一致。免疫6個月后，對各實驗組小鼠進行HTNV攻擊。結(jié)果顯示，HTNV滅活疫苗組與生理鹽水對照組小鼠部分臟器內(nèi)檢測到較高水平的病毒抗原和核酸，病理切片觀察小鼠肝臟、腎臟和肺臟出現(xiàn)炎細胞浸潤等病理改變。經(jīng)HTNVVLPS分別免疫的小鼠組織器官中病毒抗原和核酸含量均明顯低于生理鹽水對照組，且未見明顯的病理改變。表明HTNVVLPS分別免疫的小鼠均有效抵抗了病毒攻擊，而HTNV滅活疫苗免疫組小鼠不具有抵抗病毒攻擊的能力。加強免疫后，HTNV滅活疫苗免疫組和HTNVVLPS免疫組小鼠臟器中HTNV抗原和核酸載量均較生理鹽水對照組明顯降低，且臟器未見明顯病理改變，表明加強免疫后各實驗組均具有良好的動物保護作用?！窘Y(jié)論】本課題分別對前期構(gòu)建的三種HTNVVLPS生物學活性及長效免疫效果進行了研究，發(fā)現(xiàn)HTNVVLPS分別在小鼠體內(nèi)、外的實驗中發(fā)揮良好的生物學活性。在對其長效免疫研究中發(fā)現(xiàn)，HTNV滅活疫苗免疫效果差，且?guī)缀鯖]有動物保護作用，需進行加強免疫后才具有一定的免疫效果和動物保護作用。HTNVVLPS分別具有長效免疫效果，而且VLPGMCSF和VLPCD40L與VLP相比表現(xiàn)出更好的免疫效果，加強免疫可以增強HTNVVLPS的免疫效果。此外，經(jīng)HTNVVLPS分別長效免疫的小鼠能夠抵抗HTNV的攻擊，具有良好的動物保護效果，表明在HTNV嵌合VLPS具有良好的應用前景。