低氧微環(huán)境對體外培養(yǎng)hep-2頭頸鱗癌細胞系CSC增殖與分化的影響.pdf

1、頭頸鱗癌是人體常見惡性腫瘤，具有發(fā)病隱匿、侵襲性強、容易復發(fā)和轉移以及預后差的特點。盡管近年來治療技術不斷進步，治療后生活質量有所改善，但生存率并沒有得到明顯提高。頭頸鱗癌死亡率高的主要原因是治療抵抗、局部復發(fā)和遠處轉移，治療抵抗和復發(fā)一直是頭頸鱗癌治療中的一個難點和尚未徹底解決的問題。深入研究頭頸鱗癌的生物學特性、治療抵抗發(fā)生的機理，是尋求更加有效的治療手段，消除或減低頭頸鱗癌治療抵抗的關鍵所在。
　　 新近的研究證明，腫瘤的

2、起源和生長可能是由腫瘤組織內少部分處于靜止期，具有自我更新和分化能力的細胞群體所維持，由于這部分細胞具有干細胞特性，所以被稱為腫瘤干細胞(Cancer stem cells，CSC)。國內外學者己證明包括頭頸鱗癌在內的多種腫瘤中確實存在CSC，這一事實為從CSC的角度研究頭頸鱗癌治療抵抗機理及改善治療效果提供了新的思路和切入點。
　　 氧缺乏能夠誘導一系列的細胞學、生理學及分子生物學變化，進而改變細胞的正常增殖、凋亡及損傷修復等

3、進程。腫瘤微環(huán)境低氧這一因素被認為是包括頭頸鱗癌在內多種實體惡性腫瘤產(chǎn)生治療抵抗的主要原因，與腫瘤的治療后復發(fā)、治療效果差和不良預后直接相關。低氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor, HIF)作為一種低氧依賴的核轉錄蛋白，是腫瘤組織供氧和供能的中心調控因子，是腫瘤適應低氧微環(huán)境和誘導相關基因表達并克服缺氧這一不利因素的中間環(huán)節(jié)，同時參與下游多個靶基因表達的調控，成為研究腫瘤微環(huán)境低氧狀態(tài)的重要靶基因。
　　

4、 腫瘤干細胞是腫瘤細胞中的一個亞群，與分化成熟的腫瘤細胞共處相同環(huán)境中，腫瘤生長局部微環(huán)境中的低氧狀態(tài)使得CSC也必然生活于低氧微環(huán)境中。那么低氧微環(huán)境是否會影響CSC的增殖和分化，低氧微環(huán)境介導的治療抵抗是否與腫瘤干細胞相關就成為我們的關注點。本項研究從低氧微環(huán)境和腫瘤干細胞入手，研究低氧微環(huán)境對喉癌hep-2細胞系中腫瘤干細胞增殖分化的影響及其機制，并進一步探討低氧所介導的化療抵抗與腫瘤干細胞的關系。
　　 第一部分低氧微

5、環(huán)境對hep-2細胞腫瘤干細胞表型的影響
　　 目的：檢測低氧微環(huán)境中hep-2細胞的CD133表型、增殖、凋亡、細胞周期及相關基因(HIF-1α)表達的變化，探討低氧微環(huán)境對hep-2細胞腫瘤干細胞表型的影響，并進一步分析其相關機制。
　　 方法：
　　 1 低氧及常氧環(huán)境培養(yǎng)hep-2細胞，流式細胞術檢測常氧及低氧培養(yǎng)不同時間(6h、12h、24h、36h、48h)后細胞的CD133表型變化。
　　

6、2 低氧及常氧環(huán)境培養(yǎng)hep-2細胞，MTT法檢測細胞的增殖曲線。
　　 3 低氧及常氧環(huán)境培養(yǎng)hep-2細胞，流式細胞術檢測細胞的周期和凋亡情況。
　　 4 軟瓊脂克隆形成實驗檢測低氧及常氧培養(yǎng)環(huán)境下hep-2細胞的克隆形成情況。
　　 5 低氧及常氧環(huán)境培養(yǎng)hep-2細胞，RT-PCR法檢測細胞中HIF-1α mRNA表達情況。
　　 6 低氧及常氧環(huán)境培養(yǎng)hep-2細胞，Western blot法檢

7、測細胞中HIF-1α蛋白表達情況。
　　 結果：
　　 1 CD133在常氧及低氧環(huán)境下培養(yǎng)的hep-2細胞中均有陽性表達，常氧環(huán)境中培養(yǎng)的hep-2細胞中表達率為0.82±0.13％，而在低氧環(huán)境中培養(yǎng)表達率增高，在不同時間(6h、12h、24h、36h、48h)的表達率分別為1.41±0.11％、5.16±0.23％、2.43±0.15％、2.07±0.33％、1.05±0.23％。
　　 2 經(jīng)MTT法檢測

8、發(fā)現(xiàn)：低氧組hep-2細胞的增殖活性顯著高于常氧組。
　　 3 經(jīng)流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)：低氧組hep-2細胞的凋亡率顯著低于常氧組的凋亡率，并出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯。
　　 4 經(jīng)軟瓊脂克隆形成實驗檢測發(fā)現(xiàn)：hep-2細胞在低氧環(huán)境培養(yǎng)克隆形成率較高，為15.63±3.15％；而常氧環(huán)境培養(yǎng)克隆形成率為9.34±2.46％。
　　 5 經(jīng)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)：低氧組和常氧組hep-2細胞的HIF-1α mRNA

9、表達沒有明顯變化。
　　 6 經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：低氧組的HIF-1α蛋白表達較常氧組明顯增強。
　　 結論：低氧微環(huán)境可以誘導和強化hep-2細胞的腫瘤干細胞特性，其作用可能與HIF-1α蛋白的表達變化相關。
　　 第二部分人HIF-1αRNA干擾質粒的構建及HIF-1α,基因敲除hep-2細胞系的建立
　　 目的：建立人HIF-1α RNA干擾質粒，將其轉染人喉鱗癌hep-2細胞，建立

10、人喉鱗癌hep-2細胞HIF-1α基因敲除細胞系，并進一步分析該基因敲除細胞系中HIF-1α基因的表達變化。
　　 方法：
　　 1 設計合成針對人HIF-1α基因的siRNA序列，退火后與pGPU6/Hygro質粒連接，構建pGPU6/Hygro-HIF-RNAi重組質粒。
　　 2 采用脂質體法將重組質粒轉染入人喉癌hep-2細胞，抗生素篩選出穩(wěn)定轉染細胞。
　　 3 應用RT-PCR和Western

11、 blot方法檢測HIF-1α表達變化。
　　 結果：
　　 1 成功構建pGPU6/Hygro-HIF-RNAi重組質粒和人喉癌hep-2細胞HIF-1α基因敲除細胞模型。
　　 2 經(jīng)RT-PCR和Western blot法檢測HIF-1α基因在轉錄和蛋白質表達水平均有明顯下降。
　　 結論：pGPU6/Hygro-HIF-RNAi重組質粒能有效轉染人喉癌hep-2細胞并下調HIF-1α基因的表達，為

12、后續(xù)研究該基因的功能奠定了基礎。
　　 第三部分 HIF-1α基因敲除對hep-2細胞腫瘤干細胞表型的影響
　　 目的：檢測HIF-1α基因敲除后hep-2細胞的CD133表型、增殖、凋亡、細胞周期的變化，探討HIF-1α基因對hep-2細胞腫瘤干細胞表型的影響。
　　 方法：
　　 1 流式細胞術檢測hep-2細胞和HIF-1α基因敲除hep-2細胞低氧培養(yǎng)不同時間(12h和24h)后細胞的CD133表

13、型變化。
　　 2 MTT法檢測低氧環(huán)境培養(yǎng)的hep-2細胞和HIF-1α基因敲除hep-2細胞的增殖情況。
　　 3 流式細胞術檢測低氧環(huán)境培養(yǎng)hep-2細胞和HIF-1α基因敲除hep-2細胞的周期和凋亡情況。
　　 4 軟瓊脂克隆形成實驗檢測低氧培養(yǎng)環(huán)境下hep-2細胞和HIF-1α基因敲除hep-2細胞的克隆形成情況。
　　 結果：
　　 1 低氧環(huán)境下培養(yǎng)12小時和24小時的hep-2細

14、胞和HIF-1α基因敲除hep-2細胞中均有CD133陽性表達，其中hep-2細胞中表達率為5.16±0.23％和2.43±0.15％，而HIF-1α基因敲除后其表達下調，表達率分別約為1.86±0.15％和1.21±0.13％
　　 2 經(jīng)MTT法檢測發(fā)現(xiàn)：HIF-1α基因敲除后hep-2細胞的增殖活性明顯降低。
　　 3 經(jīng)流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)：HIF-1α基因敲除后hep-2細胞的凋亡率升高，并且G0/G1期阻滯變化

15、不明顯。
　　 4 經(jīng)軟瓊脂克隆形成實驗檢測發(fā)現(xiàn)：hep-2細胞在低氧環(huán)境中培養(yǎng)克隆形成率為15.63％，而HIF-1α基因敲除后克隆形成率降低，為11.96％
　　 結論：HIF-1α基因敲除能夠削弱由低氧微環(huán)境所誘導和強化的hep-2細胞腫瘤干細胞特性，HIF-1α基因在低氧微環(huán)境誘導的hep-2細胞中腫瘤干細胞的富集具有重要作用，HIF-1α可能參與腫瘤干細胞的生長調控。
　　 第四部分 HIF-1α在CD

16、133+細胞增殖及順鉑殺傷中的作用
　　 目的：探討HIF-1α在低氧培養(yǎng)CD133+細胞生長分化及DDP治療抵抗中作用，并初步研究其作用機制。
　　 方法：
　　 1 流式細胞儀分選hep-2細胞和HIF-1α基因敲除hep-2細胞中的CD133+細胞。
　　 2 有限稀釋法檢測低氧培養(yǎng)CD133+細胞克隆形成情況。
　　 3 MTT法檢測低氧培養(yǎng)DDP對CD133+細胞增殖抑制情況。
　

17、　 4 流式細胞術檢測低氧培養(yǎng)CD133+細胞中相關基因表達情況
　　 結果：
　　 1 采用流式細胞分選術成功分選不同hep-2細胞中CD133+細胞
　　 2 有限稀釋法檢測CD133+細胞克隆形成情況，低氧培養(yǎng)hep-2細胞中CD133+細胞克隆形成率較高，為85.35±3.34％；而HIF-1α基因敲除后CD133+細胞的克隆形成率降低，為50.43±5.12％。
　　 3 MTT法檢測低氧培養(yǎng)

18、順鉑對不同CD133+細胞的增殖抑制情況，發(fā)現(xiàn)順鉑對HIF-1α,基因敲除hep-2細胞中CD133+細胞的增殖抑制作用較強。
　　 4 利用流式細胞術檢測低氧培養(yǎng)hep-2細胞及HIF-1α基因敲除hep-2細胞中CD133+細胞的相關基因（Oct-4、suvivin及p53）表達情況，hep-2細胞中CD133+細胞的Oct-4、p53及Survivin蛋白表達熒光指數(shù)分別為3.64±0.21、0.88±0.16和1.39±

19、0.23;HIF-1α基因敲除hep-2細胞中CD133+細胞的Oct-4、p53及Survivin蛋白表達熒光指數(shù)分別為2.23±0.15、1.25±0.11和1.07±0.17。
　　 結論：低氧培養(yǎng)下hep-2細胞中CD133+細胞具有較強的增殖分化活性和DDP治療抵抗能力，HIF-1α基因敲除后CD133+細胞的增殖分化能力和DDP治療抵抗能力有所下降，伴隨著Oct-4、p53和Survivin表達變化。HIF-1α參與