交感神經(jīng)調(diào)控血小板生成及其對輻照小鼠血小板減少的促恢復(fù)作用.pdf

1、近年來，隨著核能在軍事、醫(yī)療、能源、食品加工、育種等鄰域的廣泛應(yīng)用，機(jī)體受到射線照射而引發(fā)的各種放射性損傷也在逐漸增加。已知骨髓對電離輻射非常敏感，因此，骨髓受到射線照射后，極易引起放射性損傷。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體受到電離輻射后，會引起骨髓多系造血功能障礙，其中由巨核系造血功能障礙引起的血小板水平數(shù)量減少可以導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)以出血、感染、代謝紊亂為代表的多種癥狀，甚至可出現(xiàn)死亡。因此，深入認(rèn)識血小板生成的調(diào)控機(jī)制，并尋找有效促進(jìn)輻射損傷后血小板

2、水平恢復(fù)的手段，是輻射損傷救治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　研究表明，機(jī)體受照后，射線可直接作用于生物大分子，造成DNA鏈斷裂，蛋白失活，或者細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或通透性改變，造成細(xì)胞損傷;電離輻射還可通過作用于水分子產(chǎn)生輻射分解產(chǎn)物，后者會再次作用于生物大分子，從而加重細(xì)胞損傷。此外，我室早期研究輻射損傷時，程天民院士等曾觀察到一種“巨核細(xì)胞被噬”(megakaryocytophagia)的現(xiàn)象，該現(xiàn)象提示骨髓巨核細(xì)胞又可以被中性粒細(xì)胞吞噬。因此，機(jī)

3、體受到放射損傷后骨髓巨核細(xì)胞(megakaryocyte，MK)和外周血血小板數(shù)量降低尤為顯著。針對該現(xiàn)狀，人們不斷尋找能夠促進(jìn)血小板生成的藥物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以血小板生成素(thrombopoietin，TPO)為代表的促血小板生成因子可通過作用于巨核細(xì)胞生成的多個階段，誘導(dǎo)造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell，HSC)增殖、分化形成成熟MKs并釋放出血小板，從而有效促進(jìn)放射損傷后血小板水平恢復(fù)。遺憾的是，TPO體內(nèi)應(yīng)

4、用并不能縮短血小板處于低谷期的時間，并可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和性抗體，從而使其應(yīng)用受到一定限制;而IL-11又是FDA批準(zhǔn)使用的唯一促血小板生成藥物。因此，尋找新的、更多的促進(jìn)放射損傷后血小板水平恢復(fù)的手段顯得尤為必要。
　　在研究電離輻射引起血小板數(shù)量減少的過程中，人們發(fā)現(xiàn)各種內(nèi)外界因素作用于機(jī)體后，會引起機(jī)體內(nèi)包括交感一腎上腺髓質(zhì)(sympathetic-adrenal medulla system，SAS)軸在內(nèi)的多個內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)軸

5、做出綜合性適應(yīng)反應(yīng)，其中SAS軸釋放的去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)和腎上腺素（epinephrine，EPI）等兒茶酚胺類物質(zhì)可通過與不種組織和細(xì)胞上相應(yīng)的受體結(jié)合，從而而發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。研究表明，骨髓有豐富的交感神經(jīng)支配，交感神經(jīng)興奮后，SAS軸釋放的NE和EPI在造血調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。前期研究結(jié)果證實，NE和EPI不僅能夠促進(jìn)CD34+細(xì)胞增殖，調(diào)控造血干/祖細(xì)胞的遷移;NE和EPI還可通過對HSCs的

6、子代細(xì)胞產(chǎn)生一系列影響，如SAS釋放的NE或EPI可通過與不同的腎上腺素受體結(jié)合，從而調(diào)控淋巴細(xì)胞生成和紅細(xì)胞生成，并參與血小板活化等過程。但是，交感神經(jīng)支配是否參與了血小板生成的調(diào)控，目前還未見相關(guān)報道。因此，深入研究交感神經(jīng)興奮在血小板生成和活化過程中的作用，不僅有助于進(jìn)一步解讀交感神經(jīng)的功能，揭示血小板生成的調(diào)控機(jī)制，而且可以為放射損傷后血小板水平恢復(fù)的救治提供新思路。
　　長期以來，本室緊緊圍繞放射損傷引起血小板數(shù)量減少的

7、發(fā)生原因，致力于血小板生成調(diào)控機(jī)制研究和相關(guān)基因工程藥物研發(fā)。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)小鼠在應(yīng)激狀態(tài)下外周血血小板處于高水平。因此，我們首先通過復(fù)制噪音和超負(fù)荷運動應(yīng)激模型，觀察連續(xù)應(yīng)激刺激后小鼠外周血血小板水平變化，分析連續(xù)應(yīng)激刺激是否能夠促進(jìn)血小板生成。在此基礎(chǔ)上，采用腎上腺素受體阻斷，β羥基轉(zhuǎn)移酶缺陷(Dbh-/-)小鼠以及血小板生成素TPO受體缺陷(C57BL/6J-Mplhlb219/J)小鼠等手段，證實交感神經(jīng)興奮是促進(jìn)體內(nèi)血小板

8、生成的重要因素;體外采用多種分析方法，檢測NE和EPI對CD34+細(xì)胞增殖和分化、巨核細(xì)胞定向分化、增殖、粘附和遷移、血小板前體形成、以及血小板釋放和活化等多個血小板生成階段的影響，分析交感神經(jīng)興奮促進(jìn)血小板生成和活化的具體機(jī)制;最后，復(fù)制放射損傷小鼠模型，探討交感神經(jīng)興奮對放射損傷小鼠的血小板水平促恢復(fù)作用。通過上述研究，取得的結(jié)果與結(jié)論如下:
　　1、復(fù)制了噪音和超負(fù)荷運動應(yīng)激模型，發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠受到連續(xù)應(yīng)激刺激后血小

9、板水平逐漸升高，提示連續(xù)應(yīng)激刺激能夠升高機(jī)體外周血血小板水平;進(jìn)一步通過綜合分析脾臟切除小鼠、多巴胺β-羥化酶缺陷（dopamineβ-hydrolylase deficient，Dbh-/-）小鼠以及C57B L/6J-Mplhlb219/J小鼠連續(xù)應(yīng)激后血小板數(shù)量變化，證實交感神經(jīng)興奮具有促進(jìn)血小板生成的作用。
　　2、在巨核細(xì)胞生成早期階段，流式檢測結(jié)果表明，NE和EPI雖然具有促進(jìn)CD34+細(xì)胞增殖的作用，但不能促進(jìn)CD3

10、4+細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化，也不能促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖。
　　3、熒光酶標(biāo)儀和Transwell檢測結(jié)果提示，NE和EPI能夠以劑量依賴方式促進(jìn)巨核細(xì)胞粘附和遷移;α受體阻斷后，NE和EPI誘導(dǎo)粘附和遷移的細(xì)胞數(shù)目顯著減少，表明NE和EPI通過α受體促進(jìn)巨核細(xì)胞粘附和遷移;
　　4、Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，NE和EPI處理可增強ERK1/2磷酸化蛋白的表達(dá)，但α及α2受體阻斷后，ERK1/2的磷酸化蛋白表達(dá)顯著減弱，提示N

11、E和EPI具有通過α2受體激活ERK1/2通路的能力;進(jìn)一步阻斷α2受體和ERK1/2信號通路后，發(fā)現(xiàn)NE和EPI誘導(dǎo)粘附和遷移的巨核細(xì)胞數(shù)目顯著減少，證實NE和EPI能夠促進(jìn)巨核細(xì)胞粘附和遷移。
　　5、激光共聚焦結(jié)果顯示，NE和EPI能夠以劑量依賴方式促進(jìn)晚期巨核細(xì)胞形成血小板前體，提示NE和EPI具有促進(jìn)巨核細(xì)胞終末分化的作用。
　　6、NE和EPI能夠上調(diào)晚期巨核細(xì)胞RhoA磷酸化蛋白的表達(dá);RhoA GTP酶活性抑

12、制后，NE和EPI誘導(dǎo)血小板前體形成的偽足延長，形成典型的“串珠樣”結(jié)構(gòu)，提示NE和EPI的促血小板前體形成作用與RhoA GTP酶的活性相關(guān)。
　　7、α2受體和ERK1/2通路阻斷可抑制NE和EPI誘導(dǎo)的RhoA磷酸化蛋白表達(dá)，并導(dǎo)致血小板前體的形成數(shù)目顯著減少，提示NE和EPI通過α2受體，激活ERK1/2-RhoA通路，是NE和EPI促進(jìn)血小板前體形成的具體機(jī)制。
　　8、流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，NE和EPI能夠促進(jìn)晚期

13、巨核細(xì)胞生成血小板，進(jìn)一步證實NE和EPI主要作用于巨核細(xì)胞終末分化階段而促進(jìn)血小板生成。
　　9、Western Blot和流式細(xì)胞儀結(jié)果綜合提示， NE和EPI與α2受體結(jié)合，激活ERK1/2通路，可能是NE和EPI促進(jìn)血小板活化的具體機(jī)制。
　　10、體內(nèi)研究結(jié)果提示，NE和EPI腹腔注射具有促進(jìn)巨核細(xì)胞向血管龕遷移，從而升高C57BL/6小鼠外周血血小板水平的作用，表明NE和EPI體內(nèi)能夠促進(jìn)血小板生成。
　　

14、11、成功復(fù)制重度放射損傷小鼠血小板減少癥動物模型（6.0 Gyγ射線全身一次性照射）。外周血血小板數(shù)量動態(tài)監(jiān)測結(jié)果顯示，NE和EPI體內(nèi)應(yīng)用可顯著升高受照小鼠外周血血小板水平;表明交感神經(jīng)興奮具有促進(jìn)放射損傷小鼠血小板水平恢復(fù)的作用。
　　12、復(fù)制了重度急性輻射損傷后骨髓移植動物模型（10.0 Gyγ射線照射后接受骨髓移植），在在血小板水平處于最低值時給予交感神經(jīng)刺激可以顯著加快血小板水平恢復(fù)速度，減輕出血傾向，進(jìn)一步證實交感