參與先天性免疫應答的miRNA的鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類由基因組編碼的長度為18～26個核苷酸的單鏈非編碼小RNA，它們廣泛存在于真核細胞中，在進化上高度保守。在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ的作用下，miRNA以前體的形式從基因組中轉錄出來。它的形成過程涉及一系列蛋白分子對其轉錄前體的剪切和轉運，最終成熟的miRNA在細胞質(zhì)中與其它相關蛋白分子一起構成沉默復合體(RISC)，通過與靶mRNA分子的3’UTR中相應序列的結合，導致靶mRNA的降解或者轉錄后翻譯受到抑制

2、。到目前為止，已在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)上萬種的miRNA，它們構成了一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，參與細胞增殖分化、生物體發(fā)育、機體免疫應答和腫瘤發(fā)生等生理及病理過程。
　　 當病原微生物入侵時，機體的先天性免疫應答會被迅速激活，并通過其介導的炎癥和抗病毒反應來殺滅和清除病原微生物。NF-κB是先天性免疫應答過程中的一個重要信號通路，當它被激活時，能夠啟動下游一系列細胞因子的轉錄，從而促進機體的炎癥反應的發(fā)生，與此同時先天性免疫應答誘導產(chǎn)生的Ⅰ型

3、干擾素在機體的抗病毒反應中也發(fā)揮了重要作用。宿主的抗感染先天性免疫應答一方面要產(chǎn)生足夠強烈的炎癥反應以徹底消滅入侵的病原微生物，另一方面又要防止這一反應的過度激活而對機體本身帶來的損傷。在這一信號轉導過程中，存在著許多正負調(diào)控因子，以保障機體先天性免疫應答的適度激活。越來越多的文獻報道m(xù)iRNA參與了先天性免疫應答，并發(fā)揮重要的調(diào)控作用。發(fā)現(xiàn)和鑒定參與調(diào)控先天性免疫應答的miRNA及對其分子機制的研究，可以加深對宿主先天性免疫應答調(diào)控的

4、理解，為研制抗感染藥物提供新的靶標。
　　 在本課題中，我們初步鑒定出了38種可能調(diào)控先天性免疫應答信號通路的miRNA，并對其中的miR-526a、miR-617和miR-623進行了進一步的功能研究。
　　 1、高通量篩選參與先天性免疫應答的miRNA：
　　 通過IFNβ和IL-1β(NF-κB調(diào)控的細胞因子)的檢測平臺，對140個miRNA進行篩選，從中鑒定出了38種參與先天性免疫應答的功能miRNA。其

5、中21種能夠上調(diào)IFNβ的表達水平，22種能夠上調(diào)IL-1β的表達水平。
　　 2、miR-526a在先天性免疫應答中功能的初步研究：
　　 通過熒光素酶報告基因和酶聯(lián)免疫吸附試驗發(fā)現(xiàn)，miR-526a能夠明顯上調(diào)IFNβ和IL-1β的表達水平。因此，我們進一步研究了miR-526a在宿主先天性免疫應答中的作用。通過熒光定量PCR的方法，我們發(fā)現(xiàn)在VSV和LPS誘導THP-1細胞的過程中，miR-526a的表達水平隨著時

6、間的變化逐漸增強，這說明miR-526a可能參與了病原體感染的宿主免疫應答。接下來，通過生物信息學的方法預測到CYLD可能是miR-526a的靶點。通過熒光定量PCR的方法，我們發(fā)現(xiàn)細胞中過表達miR-526a能夠在轉錄和翻譯水平上抑制CYLD的表達。CYLD是一個去泛素化酶，能夠通過對RIG-1的去泛素化作用抑制RIG-1的信號轉導；同時它還能夠通過與MyD88的相互作用抑制其對下游分子的磷酸化進而負調(diào)控TLR4信號通路，從而下調(diào)宿主

7、先天性免疫應答水平。上述結果初步證明miR-526a可能通過負調(diào)控CYLD的表達水平促進IFNβ和IL-1β的產(chǎn)生。
　　 3、參與炎癥反應的miR-617和miR-623在腫瘤發(fā)生中功能的初步研究：
　　 通過酶聯(lián)免疫吸附試驗發(fā)現(xiàn)，miR-617和miR-623能夠明顯上調(diào)IL-1β的表達水平，而IL-1β是受NF-κB調(diào)控的最重要的細胞因子之一。NF-κB信號通路在先天性免疫促炎癥反應中發(fā)揮著重要的作用。大量研究表明

8、，在腫瘤的發(fā)生過程中，常伴有NF-κB信號通路特征性的表達變化，其中炎癥相關分子參與了腫瘤的發(fā)生，并在腫瘤形成的不同階段起著決定性的作用。IL-1β是一個前炎癥因子，它介導的炎癥反應所產(chǎn)生的微環(huán)境能夠?qū)е抡＜毎蛔兺瑫r促進細胞的增殖。其它相關課題的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-617和miR-623在乳腺癌發(fā)生過程中表達增高，因此我們探討了miR-617和miR-623在乳腺癌發(fā)生中的作用。通過細胞計數(shù)和劃痕實驗，我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞系ZR-7

9、5-1中過表達miR-617和miR-623能夠?qū)е履[瘤細胞增殖和遷移能力的顯著增加。上述結果表明miR-617和miR-623可能通過影響細胞的炎癥反應參與腫瘤的發(fā)生，為我們進一步研究miR-617和miR-623的功能打下了基礎。
　　 綜上所述，本課題初步鑒定了38種可能參與先天性免疫應答的miRNA，進一步研究表明，miR-526a可能通過抑制負調(diào)控因子CYLD從而上調(diào)IFNβ和IL-1β的表達水平；此外參與炎癥反應的m