集胞藻PCCC6803蛋白酶Lons和C1pP2s-Xs在調(diào)控ss1004-sll0525毒素-抗毒素系統(tǒng)活性中的作用.pdf

1、原核生物細(xì)胞通常利用依賴ATP的蛋白酶Lon和Clp來(lái)控制細(xì)胞中蛋白質(zhì)的質(zhì)量,降解合成錯(cuò)誤的、變性的和不穩(wěn)定的蛋白；或調(diào)控蛋白質(zhì)活性。蛋白酶識(shí)別并與底物結(jié)合后,水解ATP使底物變性,變性的底物被轉(zhuǎn)移到蛋白酶的催化中心,肽鍵被水解。細(xì)菌染色體上的毒素.抗毒素系統(tǒng)(Toxin-antioxm system,TAsystem)作為脅迫反應(yīng)模塊,由抗毒素和毒素蛋白基因構(gòu)成,并位于同一操縱元中,分別編碼抗毒素和毒素蛋白,抗毒素與毒素形成復(fù)合體抑制

2、毒素的細(xì)胞毒性。抗毒素可被依賴ATP的蛋白酶Lon或Clp降解,是不穩(wěn)定的蛋白。因此,在正常條件下TA系統(tǒng)中的抗毒素蛋白必須持續(xù)合成,中和細(xì)胞中的長(zhǎng)壽的毒素蛋白。當(dāng)遭遇環(huán)境脅迫時(shí)蛋白質(zhì)合成受到抑制或降解抗毒素的蛋白酶被激活時(shí),細(xì)胞中毒素和抗毒素之間的平衡被破壞,游離的毒素導(dǎo)致細(xì)胞死亡或生長(zhǎng)抑制。
　　 集胞藻PCC6803染色體上存在多種ClpP蛋白酶的同源基因以及一個(gè)Lon蛋白酶基因,其中,sll0534基因編碼產(chǎn)物的序列與大

3、腸桿菌中唯一的Clp蛋白酶的催化亞基ClpP相似,并將基因分別命名為clpP2s;sll0535位于clpP2s的上游,編碼產(chǎn)物與大腸桿菌Clp蛋白酶的調(diào)控亞基ClpX相似,并將該基因命名為clpXs。sll0195預(yù)測(cè)為lon基因,并將其命名為lons。但這些基因的編碼產(chǎn)物的功能及作用對(duì)象尚不清楚。已證明集胞藻PCC6803染色體上的ssll004-sll0525基因?qū)?gòu)成一個(gè)TA系統(tǒng)。本文重點(diǎn)對(duì)集胞藻PCC6803染色體上的兩個(gè)蛋白

4、酶基因lons、clpP2s／Xs編碼產(chǎn)物在Ssll004-Sll0525TA.系統(tǒng)的活性調(diào)控中的作用進(jìn)行了研究,主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　 1)利用基因敲除方法構(gòu)建了基因lons、clpP2s／Xs缺失突變株DR386、DR400,并以細(xì)菌蛋白質(zhì)合成抑制劑壯觀霉素作為誘導(dǎo)劑,分析突變株在脅迫條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)活性,初步確定蛋白酶基因lons、clpP2s／Xs的生理功能。
　　 2)利用選擇性表達(dá)調(diào)控系統(tǒng),以受阿拉伯糖誘導(dǎo)

5、調(diào)控的啟動(dòng)子PBAO控制sll004或ssll004-sll0525的表達(dá),以受IPTG誘導(dǎo)調(diào)控的啟動(dòng)子PT7分別控制蛋白酶基因lons、clpP2s／Xs的表達(dá)。在異源宿主細(xì)胞大腸桿菌中選擇性誘導(dǎo)蛋白酶基因和抗毒素或抗毒素-毒素基因的表達(dá),通過(guò)對(duì)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)特性分析以及western-blot技術(shù)檢測(cè)抗毒素的降解確定依賴ATP的蛋白酶對(duì)ssll004-sll0525活性的調(diào)控。
　　 3)以lacZ為報(bào)告基因,分別構(gòu)建由lo

6、ns、clpP2s和ssll004-sll0525啟動(dòng)子控制報(bào)告基因表達(dá)的調(diào)控菌株,通過(guò)測(cè)定不同表達(dá)調(diào)控菌株中半乳糖苷酶(LacZ)的活性,確定lons、clpP2s和ssll004-sll0525的表達(dá)調(diào)控作用。
　　 根據(jù)上述研究,得到如下結(jié)論:
　　 1)缺失突變株DR386、DR400壯觀霉素誘導(dǎo)后細(xì)胞生長(zhǎng)活性顯著下降,提示lons、clpP2s／Xs與環(huán)境脅迫因素誘導(dǎo)蛋白質(zhì)合成抑制所致的細(xì)胞死亡或生長(zhǎng)抑制有關(guān)。

7、
　　 2)集胞藻PCC6803染色體上的蛋白酶基因lons和clpP2s／Xs的表達(dá)產(chǎn)物不但可以降解游離的抗毒素蛋白Ssll004,而且可以降解復(fù)合體蛋白Ssll004-Sll0525中的抗毒素蛋白Ssll004。
　　 3)對(duì)異源表達(dá)調(diào)控菌株中LacZ活性測(cè)定結(jié)果表明,在正常生長(zhǎng)條件下lons啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄活性,但clpP2s啟動(dòng)子無(wú)顯著的轉(zhuǎn)錄活性；抗毒素蛋白Ssll004對(duì)啟動(dòng)子Pssll004活性具有顯著的抑制作