丙酸睪酮抑制TGF-β-Smad信號通路改善年齡相關(guān)腎纖維化作用的研究.pdf

1、目的：腎纖維化被認(rèn)為是導(dǎo)致各種不同的原因的慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期的不可逆轉(zhuǎn)的常見病理通路。因此，如何防治腎纖維化是非常重要的。腎纖維化的特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM）蛋白的過度積累。此外，基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases, MMPs）是能夠分解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的多功能酶?；|(zhì)金屬蛋白酶活性是通過多種因素調(diào)控的，包括組織金屬蛋白酶抑制劑（Tissue inhib

2、itor of matrix metalloproteinases, TIMPs）的抑制作用。隨著年齡增長，男性體內(nèi)睪酮水平含量降低。腫瘤生長因子β（Tumor growth factorβ, TGF-β）信號通路在腎纖維化的發(fā)病過程中具有關(guān)鍵作用。TGF-β1通過激活其下游Smad信號通路可以引起腎纖維化的發(fā)生。目前，尚不清楚外源性睪酮干預(yù)，能否改善老年雄性大鼠腎纖維化的過程。探討長期丙酸睪酮（Testosterone propion

3、ate, TP）處理對老年大鼠腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)和腎功能的影響及TGF-β/Smad信號通路參與的機(jī)制。
　　方法：雄性Wistar大鼠共30只隨機(jī)分成3組。6月齡組（6Mon，n=10），24月齡組（24Mon，n=10）和24月齡皮下TP處理組（24Mon-TP，n=10）。24Mon-TP組大鼠在大鼠21月齡時皮下注射TP，劑量2mg/kg，每日1次，共計給藥12周（84天）。6Mon組和24Mon組大鼠同時只皮下注射芝麻油。每組

4、各5只大鼠用于HE染色和馬松三色染色，收集靜脈血用于血清ELISA測定，另外5只大鼠用于實(shí)時定量PCR和免疫印跡檢測。
　　結(jié)果：
　　1 HE染色結(jié)果
　　6月齡大鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰完整，老年24月齡大鼠腎臟出現(xiàn)顯著地退行性變化與腎小管變性、管狀細(xì)胞腫脹、細(xì)胞液泡化以及腎皮質(zhì)腎小球變性。長期TP補(bǔ)充后能夠改善上述組織病理學(xué)變化。
　　2馬松三色染色結(jié)果
　　與6月齡大鼠相比，老年24月齡大鼠腎臟藍(lán)色染色區(qū)域面

5、積的平均百分比顯著增加（P<0.01）；與24月齡大鼠相比，長期TP處理后藍(lán)色染色區(qū)域面積的平均百分比顯著降低（P<0.01），但未達(dá)到6月齡組大鼠水平（P<0.01）。
　　3血清酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA）檢測結(jié)果
　　與6月齡大鼠相比，老年24月齡大鼠腎臟胱抑素C（Cystatin C, CysC）、TIMP-1和TIMP-2的含量顯著增加（P<

6、0.01），MMP-2和MMP-9的含量顯著降低（P<0.01）；與24月齡大鼠相比，長期TP處理后CysC、TIMP-1和TIMP-2的含量顯著降低（P<0.01），MMP-2和MMP-9的含量顯著增加（P<0.01），但均沒有恢復(fù)到6月齡水平。
　　4腎臟CollagenⅣ的實(shí)時定量PCR和免疫印跡結(jié)果
　　實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果顯示，與6月齡大鼠相比，老年24月齡大鼠腎臟CollagenⅣmRNA的表達(dá)顯著增加（P<0

7、.01）；與24月齡大鼠相比，長期TP處理后CollagenⅣmRNA的表達(dá)顯著降低（P<0.01），但沒有恢復(fù)到6月齡水平（P<0.05）。
　　免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與6月齡大鼠相比，老年24月齡大鼠腎臟CollagenⅣ蛋白的表達(dá)顯著增加（P<0.01），長期TP處理后CollagenⅣ蛋白的表達(dá)顯著降低（P<0.01），但未達(dá)到6月齡組大鼠水平（P<0.01）。
　　5腎臟MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIM

8、P-2的實(shí)時定量PCR和免疫印跡結(jié)果
　　實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果顯示，與6月齡大鼠相比，老年24月齡大鼠腎臟MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá)顯著降低（P<0.01），TIMP-1 mRNA和TIMP-2 mRNA的表達(dá)顯著增加（P<0.01）；與24月齡大鼠相比，長期 TP處理后 MMP-2 mRNA和 MMP-9 mRNA的表達(dá)顯著增加（P<0.05），TIMP-1 mRNA和TIMP-2 mRNA的表達(dá)顯著降低

9、（P<0.01），但均沒有恢復(fù)到6月齡水平（P<0.05或P<0.01）。
　　免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與6月齡大鼠相比，老年24月齡大鼠腎臟MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)顯著降低（P<0.01），TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)顯著增加（P<0.01）；與24月齡大鼠相比，長期TP處理后MMP-2和MMP-9的表達(dá)顯著增加（P<0.01），TIMP-1和TIMP-2蛋白的表達(dá)顯著降低（P<0.01），但均沒有恢復(fù)到6月齡水平（P

10、<0.01）。
　　6腎臟TGF-β1、Smad2、Smad3和Smad4的實(shí)時定量PCR和免疫印跡結(jié)果
　　實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果顯示，與6月齡大鼠相比，老年24月齡大鼠腎臟TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA和 Smad4 mRNA的表達(dá)顯著增加（P<0.01）；與24月齡大鼠相比，長期TP處理后TGF-β1 mRNA、Smad2 mRNA、Smad3 mRNA和 Smad4 mRNA的表達(dá)

11、顯著降低（P<0.01），但均沒有恢復(fù)到6月齡水平（P<0.01）。
　　免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與6月齡大鼠相比，老年24月齡大鼠腎臟TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3和Smad4蛋白的表達(dá)顯著增加（P<0.01）；與24月齡大鼠相比，長期TP處理后TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3和Smad4蛋白的表達(dá)顯著降低（P<0.01），但均沒有恢復(fù)到6月齡水平（P<0.01）。
　　結(jié)論：長期TP補(bǔ)充能