基于c-FLIP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相互作用探討解毒方改善索拉非尼耐藥的作用機(jī)制.pdf

1、背景:索拉非尼(Sorafenib，Sora)是臨床上治療中晚期肝癌推薦使用的分子靶向治療藥物，但是在治療過程中會(huì)出現(xiàn)各種副作用，更重要的是，有相當(dāng)一部分病人會(huì)對(duì)sorafenib產(chǎn)生耐藥。當(dāng)前針對(duì)sorafenib耐藥的機(jī)制研究紛繁復(fù)雜，涉及諸多信號(hào)通路和生物分子，然而目前的研究尚不能全面揭示sorafenib耐藥的機(jī)制。文獻(xiàn)報(bào)道，sorafenib可以激活CD95/Fas誘導(dǎo)外源性凋亡，而caspase-8是外源性凋亡途徑中重要的起

2、始蛋白，caspase-8激活后可以引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)。c-FLIP是caspase-8的重要抑制蛋白，在許多腫瘤中高表達(dá)，與凋亡抑制密切相關(guān)。同時(shí)c-FLIP位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum，ER)膜上，具有調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)的作用，而后者與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與化療藥物抵抗。由此我們設(shè)想，c-FLIP/ERS信號(hào)通路是否參與調(diào)節(jié)sorafeni

3、b耐藥，是引起sorafenib耐藥的機(jī)制之一？同時(shí)，課題組成員在中醫(yī)藥防治肝癌方面具有一定的研究基礎(chǔ)且具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，并在長期的臨床研究中總結(jié)經(jīng)驗(yàn)和用藥，歸納出中藥小復(fù)方“解毒方”(Jiedu Fang，JDF)，以此方為基礎(chǔ)開展的多中心臨床研究發(fā)現(xiàn)，可以延長晚期肝癌患者的生存期，尤其是部分sorafenib耐藥或者副作用較大的病人。中醫(yī)藥在逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，那么中藥小復(fù)方“解毒方”能否可以改善索拉非尼耐藥，其機(jī)

4、制是否涉及調(diào)節(jié)c-FLIP/ERS?
　　研究目的:1.構(gòu)建sorafenib耐藥人肝癌細(xì)胞株，并觀察sorafenib對(duì)敏感/耐藥肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。2.分別觀察sorafenib對(duì)敏感/耐藥肝癌細(xì)胞株ERS及下游凋亡和自噬通路的作用，并研究c-FLIP對(duì)ERS和相關(guān)凋亡通路的影響，探討其調(diào)節(jié)耐藥的可能機(jī)制。3.體外探討解毒方改善sorafenib耐藥是否通過調(diào)節(jié)c-FLIP與ERS相關(guān)通路發(fā)揮作用。4.進(jìn)一步在體內(nèi)論證解

5、毒方聯(lián)合sorafenib對(duì)于耐藥肝癌細(xì)胞皮下移植瘤的抑制作用。
　　研究方法:1.采用HepG2、Huh7肝癌細(xì)胞，通過MTT篩選sorafenib藥物濃度，選擇略低于IC50的藥物濃度開始長期持續(xù)的sorafenib藥物干預(yù)，誘導(dǎo)為HepG2-R、Huh7-R耐藥肝癌細(xì)胞株，通過MTT、流式分別檢測細(xì)胞增殖、凋亡，驗(yàn)證耐藥細(xì)胞株HepG2-R、Huh7-R是否構(gòu)建成功。2.觀察ERS相關(guān)通路在sorafenib耐藥中的作用，并

6、采用ERS抑制劑4-苯基丁酸（4-Phenylbutyric acid，4-PBA）反相驗(yàn)證，進(jìn)一步比較敏感株和耐藥株中ERS引起的凋亡及自噬情況，WB檢測相關(guān)蛋白表達(dá)，電鏡下觀察自噬體的形成，研究ERS在sorafenib耐藥中的作用。3.根據(jù)ERS對(duì)相關(guān)凋亡通路的影響，觀察凋亡抑制蛋白c-FLIP在sorafenib耐藥中的作用，并采用siRNA干擾技術(shù)及過表達(dá)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。4.體外觀察解毒方對(duì)sorafenib耐藥的改善作用，并通

7、過Westernblot檢測聯(lián)合用藥對(duì)c-FLIP和ERS蛋白的影響，探討其可能機(jī)制。5.通過構(gòu)建soranfenib耐藥人肝癌細(xì)胞株皮下移植瘤裸鼠模型，在體內(nèi)觀察解毒方改善sorafenib耐藥作用及可能機(jī)制。
　　結(jié)果:1.成功構(gòu)建sorafenib耐藥人肝癌細(xì)胞株HepG2-R、Huh7-R，sorafenib培養(yǎng)濃度分別為6.0μM、9.0μM。Sorafenib處理后，計(jì)算HepG2-R、HepG2的IC50，48h時(shí)分

8、別為18.17μM、9.26μM，72h時(shí)分別為12.74μM、6.48μM，Huh7-R、Huh7的IC50，48h時(shí)分別為23.36μM、10.13μM，72h時(shí)分別為16.88μM、5.84μM，各組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);流式分別檢測耐藥株和敏感株的結(jié)果與MTT結(jié)果相一致，48小時(shí)耐藥株凋亡率明顯低于敏感株(P＜0.05);進(jìn)一步檢測凋亡相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，在相同濃度的sorafenib作用下，敏感細(xì)胞中的PARP、

9、caspase-8、caspase-3激活比耐藥株更明顯。
　　2.研究ERS在sorafenib耐藥過程中的作用，通過比較敏感/耐藥細(xì)胞ERS相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞IRE1和PERK信號(hào)通路激活程度更高，部分ERS蛋白表達(dá)水平更高，使用ERS抑制劑4-PBA可以使耐藥株對(duì)sorafenib的敏感性增加，降低PERK、Bip的表達(dá)水平，上調(diào)Chop水平，凋亡蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-3、PARP活

10、化。但是對(duì)ERS凋亡相關(guān)caspase-12的影響不明顯。進(jìn)一步研究ERS相關(guān)自噬發(fā)現(xiàn)，與敏感株比較，耐藥細(xì)胞自噬水平較高，P62表達(dá)減少，LC3Ⅱ表達(dá)明顯增加，ERS抑制劑4-PBA聯(lián)合sorafenib能夠使P62增加，使LC3Ⅰ向Ⅱ轉(zhuǎn)化減少，電鏡觀察到了相似的結(jié)果，耐藥株與sorafenib處理組可以看到較多的自噬體，而4-PBA處理后，自噬體數(shù)量則明顯減少;分別給予自噬抑制劑3-Methyladenine(3-MA)和Chlor

11、oquine(CQ)處理耐藥株后，sorafenib對(duì)耐藥株的增殖抑制率和凋亡率明顯增加。
　　3.通過比較敏感株和耐藥株中凋亡蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-12，我們發(fā)現(xiàn)，caspase-8在經(jīng)過sorafenib處理的敏感細(xì)胞中被顯著激活，而在耐藥株中則不易被激活，因此我們進(jìn)一步觀察caspase-8抑制蛋白c-FLIP在sorafenib耐藥中的作用。Sorafenib處理后，耐藥細(xì)胞中c-FL

12、IP的表達(dá)要高于敏感細(xì)胞;采用siRNA干擾c-FLIP后，無論是耐藥的Huh7-R細(xì)胞還是HepG2-R細(xì)胞對(duì)sorafenib的敏感性都顯著增加，c-FLIP siRNA組與NC組比較，細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率增加(P＜0.05);進(jìn)一步觀察c-FLIP siRNA干擾對(duì)ERS相關(guān)蛋白和caspase-8的影響，經(jīng)過sorafenib處理，HepG2-R的PERK、Bip水平降低，Chop水平升高，caspase-8剪切體明顯增多，表

13、明c-FLIP在調(diào)節(jié)耐藥細(xì)胞的ERS相關(guān)通路和抑制caspase-8激活方面發(fā)揮了重要作用。過表達(dá)c-FLIP后，可以降低解毒方聯(lián)合sorafenib對(duì)于耐藥細(xì)胞的抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)，解毒方通過降低c-FLIP改善sorafenib耐藥。
　　4.解毒方在體外可以改善sorafenib耐藥。將不同濃度的解毒方(JDF0.1mg/ml、JDF0.2mg/ml、JDF0.4mg/ml)、sorafenib(Sora2.5μM、Sor

14、a5μM、Sora7.5μM)以及解毒方(JDF0.2mg/ml、JDF0.4mg/ml、JDF0.5 mg/ml)、sorafenib(Sora5μM、Sora10μM、Sora15μM)分別作用于耐藥HepG2-R和Huh7-R細(xì)胞48h，未發(fā)現(xiàn)明顯的增殖抑制作用，存活率均大于80％(P＞0.05)。而將不同濃度的JDF與sorafenib聯(lián)合應(yīng)用，則可以顯著增加sorafenib耐藥株的抑制率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，

15、且成一定的濃度依賴性，通過計(jì)算聯(lián)合作用指數(shù)(combined index，CI)，CIHepG2-R=0.58(JDF0.4mg/ml+Sora5μM)，CIHuh7-R=0.33(JDF0.5mg/ml+Sora5μM)，表明JDF和sorafenib具有一定協(xié)同作用。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，JDF和sorafenib聯(lián)合作用后，c-FLIP表達(dá)降低，且呈濃度依賴性，PERK通路激活，Chop水平上調(diào)。
　　5.體內(nèi)結(jié)

16、果提示，JDF聯(lián)合sorafenib可以顯著抑制耐藥細(xì)胞皮下瘤生長。構(gòu)建Huh7、Huh7-R皮下移植瘤裸鼠模型，兩組裸鼠給予低劑量sorafenib干預(yù)約4周后，僅Huh7-R組裸鼠出現(xiàn)皮下移植瘤，Huh7組未見明顯皮下瘤，表明體內(nèi)耐藥模型構(gòu)建成功，分別給予Vehicle、Sorafenib、JDF+Sorafenib、JDF干預(yù)15天后，Sorafenib與JDF組的瘤重與Vehicle組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而J

17、DF+Sorafenib組瘤重低于Vehicle組瘤重，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，通過Western Blot檢測腫瘤組織中的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，JDF聯(lián)合sorafenib能夠激活I(lǐng)RE1和PERK通路，上調(diào)促凋亡chop蛋白水平，同時(shí)抑制c-FLIP表達(dá)，激活caspase-8，與體外結(jié)果一致。此外，各組裸鼠肝腎組織病理結(jié)果提示，本實(shí)驗(yàn)中JDF與sorafenib聯(lián)合應(yīng)用無體內(nèi)毒性。
　　結(jié)論:1.索拉非尼耐藥與c-FL