海南省HCV分子分型、分子進(jìn)化及黎族HCV基因型6特殊病毒株的全基因組研究.pdf

1、背景:
　　目前，全球有近1.8億人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，而在中國(guó)約1000萬為抗-HCV陽性。HCV至今尚缺有效的疫苗。依據(jù)Simmond系統(tǒng)，HCV可分為7個(gè)基因型和85個(gè)確定的以及20個(gè)待定的基因亞型。對(duì)HCV基因型分布及分子流行病學(xué)的研究，有助于控制HCV的播散。最新研究表明，中國(guó)HCV基因型以1b為主，占56.8％(582/997);其次為2型、3型和6型。但是，中國(guó)的南北地區(qū)H

2、CV基因型組成和播散趨勢(shì)不盡一致。與北方不同，6a在華南地區(qū)已經(jīng)取代2a成為當(dāng)?shù)氐牡诙€(gè)主要流行的HCV基因亞型，并曾在廣東河源發(fā)生快速流行。海南島毗鄰廣東省，主要居民為漢族(83.33％)，其次是黎族(14.73％)。至今對(duì)海南島的HCV分子流行病學(xué)研究較少。
　　此外，海南黎族族源研究顯示，其與南島語系的多個(gè)族群有明顯遺傳淵源關(guān)系，其被稱為“人類進(jìn)入東亞入口的古老活化石”。至今HCV基因型6的各個(gè)亞型主要發(fā)現(xiàn)在東南亞地區(qū)流行。

3、HCV基因型6因其遺傳差異最大，亞型最復(fù)雜，已被視為HCV的最古老的病毒株，目前仍不斷地發(fā)現(xiàn)新的HCV基因型6特殊病毒株——指不能歸入已知的亞型的病毒株。HCV基因型6特殊病毒株由于病毒載量低、遺傳差異大和缺乏參照序列，因此對(duì)該類病毒進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增是世界難題。前期研究發(fā)現(xiàn)部分來源于海南黎族的HCV基因型6病毒起源古老且獨(dú)特。因此，對(duì)海南黎族的HCV基因型6特殊病毒株進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增，研究海南黎族的HCV基因型6與東南亞其他地區(qū)該型病毒的進(jìn)化關(guān)

4、系，將有助于補(bǔ)充該型病毒的生活史研究。
　　目的:
　　1.本研究首先通過研究海南省漢族和黎族人群中的HCV基因型分布和臨床特點(diǎn)、高危因素來了解海南省HCV的感染概況。
　　2.應(yīng)用系統(tǒng)發(fā)育樹分析(phylogenetic anlynasis)來了解海南漢族地區(qū)HCV的來源、傳播模式和規(guī)律。
　　3.從黎族中的HCV基因型6特殊病毒株中，對(duì)兩株未知的病毒株HN1316和HN1350進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增和測(cè)定。進(jìn)一步

5、分析黎族“HCV基因型6特殊病毒株”與東南亞地區(qū)的HCV基因型6毒株的進(jìn)化關(guān)系。
　　方法:
　　1.樣品來源:納入2013.1～2014.6間收集的HCV-RNA陽性慢性HCV感染者血清標(biāo)本246例（其中漢族176例，黎族70例）?；虻臄U(kuò)增和測(cè)序:巢式PCR擴(kuò)增并測(cè)序Core-E1。數(shù)據(jù)分析:應(yīng)用系統(tǒng)發(fā)育樹分析海南漢族和黎族人群中HCV基因型的分布特點(diǎn)。
　　2.應(yīng)用BEAST1.6軟件和貝葉斯—馬爾科夫鏈—蒙特卡

6、洛(Bayesian—MCMC)方法對(duì)海南漢族與中國(guó)其他地區(qū)漢族的HCV序列進(jìn)行種系地理學(xué)分析。最后，擴(kuò)大海南漢族的慢性HCV感染者的病例數(shù)至402例，檢測(cè)其基因分型，系統(tǒng)分析這些患者的流行病學(xué)特點(diǎn)和臨床特點(diǎn)，Logistic回歸分析海南地區(qū)HCV感染的高危因素。
　　3.設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物及特異性引物，通過“DNA walking on bridges and islands”策略進(jìn)行多片段PCR擴(kuò)增并測(cè)定兩株未知的黎族病毒株——HN

7、1316和HN1350的全基因組序列。繼而采用生物信息學(xué)軟件，進(jìn)行核苷酸相似性分析，構(gòu)建ML(Maximun Likelihood)系統(tǒng)進(jìn)化樹以估算它們的系統(tǒng)進(jìn)化位置，進(jìn)行基因重組測(cè)定分析，來確定新的基因亞型。
　　結(jié)果:
　　1.海南省漢族人群的HCV流行概況:
　　(1)海南省漢族的163例樣本基因型分布為:6a是最主要的亞型，其次是1b、3b、3a、2a和1a:6a為33.7％(55/163)，1b為33.1％(

8、54/163)，3b為14.7％(24/163)，2a為6.7％(11/163)，3a為8.6％(14/163)和1a為3％(5/163)。
　　(2)種系地理學(xué)分析發(fā)現(xiàn):海南的HCV與中國(guó)其它地區(qū)漢族的HCV交替分布于每一簇中。
　　進(jìn)而，擴(kuò)大至402例后的檢測(cè)基因型分布、流行病學(xué)特點(diǎn)和臨床特點(diǎn)如下:
　　(3)6a仍是最主要的亞型:其次是1b、3b、3a、2a和1a。
　　(4)Logistic分析表明:海南

9、HCV傳播的高危因素分別是使用過污染的醫(yī)療器械(P＜0.05)、使用血制品(P＜0.05)和靜脈吸毒(P＜0.01);卡方檢驗(yàn)顯示6a亞型中靜脈吸毒明顯高于其他亞型(P＜0.01)。
　　2.海南省黎族58例的基因型分布為:基因型6為94.8％(55/58)，1b為1.72％(1/58)、2a為1.72％(1/58)、3b為1.72％(1/58)。進(jìn)一步對(duì)55例HCV基因型6分析發(fā)現(xiàn):6a為3.5％(2/58)，6xa為3.5％(

10、2/58)，6w為5.2％(3/58)，6e為1.7％(1/58)，6v為1.7％(1/58)，6r為1.7％(1/58)，特殊病毒株為77.6％(45/58)。系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示這45株病毒明顯有別于東南亞其他地區(qū)的病毒株而集聚為獨(dú)立的進(jìn)化簇。
　　3.成功對(duì)HN1316和HN1350成功進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。分析發(fā)現(xiàn):兩個(gè)病毒株與其他已知的6型全長(zhǎng)序列的基因相似性在70～80％;接著構(gòu)建ML系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，HN1350與印度尼西亞

11、、香港地區(qū)發(fā)現(xiàn)的6g、6w有著共同的祖先，HN1316與6a、6b、6xd和6_ZS202、老撾地區(qū)發(fā)現(xiàn)的6_L373有著共同祖先。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)無明顯流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的三個(gè)病毒株:HN1350(全長(zhǎng))、HN1314和HN1411三個(gè)序列之間基因差異在7.6～14％。
　　結(jié)論:
　　1.6a是海南漢族中最主要的感染基因型，其次為1b，提示6a在我國(guó)可能已經(jīng)開始從廣東地區(qū)快速傳播開來。海南島雖然與大陸隔海相望，但是海南省漢族人群

12、同屬于中國(guó)大陸漢族的HCV傳播網(wǎng)絡(luò)。
　　2.海南黎族人群的HCV以基因6型為主，并發(fā)現(xiàn)多株基因6型的特殊病毒株且高度聚集，提示HCV基因型6病毒可能在黎族地區(qū)封閉地緩慢傳播了非常長(zhǎng)的時(shí)期。
　　3.首次在黎族中發(fā)現(xiàn)一個(gè)HCV基因型6的新亞型?；蛳嗨菩越Y(jié)果顯示HN1316和HN1350屬于HCV基因型6，但不能歸于已知亞型;這兩個(gè)病毒株與東南亞周邊地區(qū)來源的病毒有共同祖先，提示海南黎族可能是HCV基因型6起源的一部分;本研