PAK4與P54蛋白相互作用的驗(yàn)證.pdf

1、目的：
　　 p21活化激酶(p21-activated kinase,PAK)為一類進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。PAK在許多組織中廣泛表達(dá),為Rho家族小鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPase)Cdc42/Rac、生長因子和細(xì)胞外信號(hào)的下游主要靶蛋白,參與許多重要細(xì)胞活動(dòng)。PAK家族共有6個(gè)家族成員:皆含有氨基末端(N-末端)調(diào)節(jié)區(qū)和羧基末端(C-末端)激酶區(qū)。根據(jù)它們結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及相似性,可分為兩大類:Ⅰ類PAK(PAK1-

2、PAK3)和Ⅱ類PAK(PAK4-PAK6)。兩類PAK在結(jié)構(gòu)、活化方式、生物學(xué)功能上有著很大的區(qū)別,它們具有不同的下游靶蛋白。PAK4是目前研究的最為廣泛的Ⅱ類PAK,其功能特點(diǎn)比較明確。隨著PAK4下游蛋白的不斷發(fā)現(xiàn),已明確其在許多生物學(xué)活動(dòng)如細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn),PAK4還參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。
　　 P54是本實(shí)驗(yàn)室利用酵母雙雜交技術(shù)從人胎腦cDNA文庫中篩選出的PAK4新的相互

3、作用蛋白。P54蛋白是一種神經(jīng)特異性的蛋白,在神經(jīng)生長過程中能夠在生長核處富集,調(diào)節(jié)軸突的延伸,P54蛋白能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和(CNS)周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中表達(dá),是有效的微管不穩(wěn)定因子,膜相關(guān)蛋白。也有相關(guān)文章報(bào)道,P54蛋白與腫瘤有一定的聯(lián)系。P54的發(fā)現(xiàn)為PAK4腫瘤信號(hào)通路的進(jìn)一步完善提供了新的依據(jù),為PAK4參與神經(jīng)元的發(fā)育以及遷移過程提供新的線索。本課題旨在證實(shí)PAK4與P54的相互作用關(guān)系,進(jìn)而初步探討其生物學(xué)功能。

4、r>　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、基因克隆相關(guān)分子生物學(xué)試劑。
　　 2、酵母雙雜交和酵母質(zhì)粒提取相關(guān)試劑。
　　 3、體外轉(zhuǎn)錄試劑盒。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、順序轉(zhuǎn)染法篩選PAK4相互作用蛋白P54。
　　 2、在AH109酵母菌中驗(yàn)證PAK4與P54相互作用。
　　 3、在大腸菌BL21中誘導(dǎo)P54蛋白的表達(dá)并純化。
　　 4、利

5、用GST-pull down實(shí)驗(yàn)體外驗(yàn)證PAK4與P54相互作用。
　　 5、利用免疫沉淀驗(yàn)證PAK4與P54在體內(nèi)相互作用。
　　 6、利用免疫熒光方法觀察P54亞細(xì)胞定位及與PAK4的共定位。
　　 結(jié)果
　　 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選出PAK4新的相互作用蛋白P54,將其共轉(zhuǎn)到AH109酵母菌中,進(jìn)行酵母體內(nèi)驗(yàn)證,結(jié)果顯示兩者能夠相互作用。GST-pull down實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了兩者在體外的相互作用

6、。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩者的體內(nèi)相互作用。通過共聚焦顯微鏡觀察P54蛋白定位在細(xì)胞漿,且P54與PAK4兩者在細(xì)胞漿有共定位。
　　 結(jié)論
　　 1、P54是PAK4新的相互作用蛋白。
　　 2、通過酵母雙雜交共轉(zhuǎn)染技術(shù),驗(yàn)證了PAK4與P54之間發(fā)生相互結(jié)合。
　　 3、通過體內(nèi)IP和體外GST-pull down實(shí)驗(yàn)證實(shí)PAK4能與P54相互作用。
　　 4、通過共聚焦實(shí)驗(yàn)證實(shí)P54定位在細(xì)胞漿