新型MyD88抑制劑作用機制及其在防治結腸炎相關性結直腸癌中的作用及機理研究.pdf

1、第一部分新型MyD88抑制劑TJ-M2010-5抑制MyD88二聚化的作用及機制探討
　　目的：探討新型MyD88抑制劑TJ-M2010-5抑制MyD88同源二聚化和異源二聚化的作用并闡明其機理，為計算機輔助藥物設計提供實驗依據。
　　方法：體外構建Flag-MyD88 pcDNA3.1-，HA-MyD88 pcDNA3.1-和 Flag-TIRAP pcDNA3.1-質粒，采用免疫共沉淀方法，將 Flag-MyD88 pc

2、DNA3.1-和 HA-MyD88 pcDNA3.1-共轉染 HEK293T細胞，以及 Flag-TIRAP pcDNA3.1-和 HA-MyD88 pcDNA3.1-共轉染HEK293T細胞，并給與不同濃度TJ-M2010-5干預（0μM，10μM，40μM），轉染48小時后檢測MyD88-MyD88以及TIRAP-MyD88的結合能力。體外誘導培養(yǎng) BALB/c小鼠不成熟骨髓源性樹突狀細胞，培養(yǎng)第7天給予不同濃度TJ-M2010-5

3、干預（0μM，10μM，40μM）2小時后，給予LPS刺激活化TLR信號通路，48小時后，通過EMSA方法檢測細胞核內轉錄因子NF-κB的含量，ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β表達水平。
　　結果：TJ-M2010-5劑量依賴性的抑制MyD88-MyD88和TIRAP-MyD88結合能力，隨著劑量增加，抑制作用加強。體外誘導培養(yǎng)BALB/c小鼠，給予不同濃度TJ-M2010-5干預和LPS刺激后，TJ-M20

4、10-5抑制NF-κB入核，以及TNF-α和IL-1β的表達水平，并且隨著TJ-M2010-5濃度增加，抑制作用逐漸加強。
　　結論：TJ-M2010-5通過干擾MyD88-MyD88同源二聚化和TIRAP-MyD88異源二聚化從而發(fā)揮了抑制MyD88二聚化的作用，同時，TJ-M2010-5進一步抑制了TLR/MyD88信號通路的活化。因此，TJ-M2010-5可以作為一種有效的MyD88抑制劑干預依賴MyD88的TLR信號通路，

5、為將來應用于臨床奠定理論基礎。
　　第二部分新型MyD88抑制劑TJ-M2010-5防治結腸炎相關性結直腸癌的作用及機制探討
　　目的：探討新型MyD88抑制劑TJ-M2010-5在防治AOM/DSS誘發(fā)小鼠CAC中的作用及機制，為TJ-M2010-5進一步臨床應用提供實驗依據。
　　方法：通過聯合使用AOM和DSS誘導小鼠CAC模型，并給予TJ-M2010-5干預。小鼠腹腔注射大劑量TJ-M2010-5后，通過觀察小

6、鼠活動度等指標以評估藥物急性毒性；小鼠腹腔注射常規(guī)劑量 TJ-M2010-5后，通過檢測小鼠血常規(guī)指標，肝臟、腎臟 HE染色以評估藥物亞急性毒性。實驗分為三組：Normal組，AOM/DSS組，TJ-M2010-5組。觀察10周，記錄建模后小鼠體重變化，生存率差異。體外培養(yǎng)RAW264.7細胞，TJ-M2010-5干預后給予LPS刺激，檢測細胞內IRAK4、p38、Erk磷酸化水平，同時，通過EMSA方法檢測結腸組織中NF-κB入核能力

7、，以評估TJ-M2010-5對CAC小鼠TLR/MyD88信號通路的影響。大體觀察小鼠結腸腫瘤形成情況并通過HE染色分析腫瘤惡性程度，COX2免疫組織化學染色和Western blot分析評價腫瘤進展情況。結腸HE染色檢查評估炎癥反應程度，MPO免疫組織化學染色檢測中性粒細胞浸潤情況。BrdU摻入法和Ki-67染色檢查結腸上皮細胞增殖狀況，活性caspase-3染色和TUNEL染色檢查結腸上皮細胞凋亡狀況。Bio-Plex和ELISA方

8、法分析CAC小鼠血清細胞因子蛋白表達水平，qPCR方法分析結腸細胞因子mRNA水平。免疫組織化學染色方法檢測結腸CD68+巨噬細胞浸潤情況，流式細胞技術分析結腸LPMC中巨噬細胞、DC、CD4+T細胞比例，qPCR方法分析LPMC中巨噬細胞IL-6 mRNA水平。
　　結果：聯合使用 AOM和 DSS成功誘發(fā)了小鼠 CAC模型。藥物安全性評估顯示TJ-M2010-5不會對小鼠產生急性和亞急性毒性作用。TJ-M2010-5抑制了 C

9、AC小鼠TLR/MyD88信號通路活性。與AOM/DSS組相比，長期給予TJ-M2010-5干預后，小鼠死亡率從53％降低至0%，惡性腫瘤發(fā)生率從100%降至0%，并進一步抑制了CAC小鼠體重下降的趨勢，降低了結腸上皮細胞增殖能力并促進了上皮細胞凋亡，抑制了結腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展并降低了腫瘤惡性程度。同時，TJ-M2010-5干預抑制了細胞因子的分泌以及結腸組織中性粒細胞和免疫細胞的浸潤，調節(jié)了結腸組織炎性微環(huán)境。
　　結論：異常的T