丹參多酚酸對(duì)慢性應(yīng)激后小鼠認(rèn)知功能的改善作用及其機(jī)制.pdf

1、目的:應(yīng)激(stress)是機(jī)體在各種內(nèi)外環(huán)境因素及社會(huì)、心理因素刺激時(shí)所出現(xiàn)的全身性非特異性適應(yīng)反應(yīng)，又稱為應(yīng)激反應(yīng)，這些刺激因素稱為應(yīng)激原。隨著社會(huì)的發(fā)展和進(jìn)步，應(yīng)激因素越來(lái)越多，同時(shí)也越來(lái)越受到人們的重視。一般情況下，身體和大腦的各個(gè)方面都會(huì)受到應(yīng)激因素的影響。慢性應(yīng)激與認(rèn)知功能的損傷有關(guān)，同時(shí)會(huì)引起神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和大腦蛋白的改變。
　　但是，應(yīng)激影響認(rèn)知的確切機(jī)制尚不清楚，臨床也缺乏有效的預(yù)防和治療藥物。應(yīng)激相關(guān)性認(rèn)知功能

2、障礙與突觸蛋白和神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)作為生長(zhǎng)因子家族的一員，在記憶和突觸可塑性中起重要的作用。有研究表明，重復(fù)應(yīng)激后海馬神經(jīng)元萎縮，BDNF表達(dá)下調(diào)，同時(shí)出現(xiàn)記憶障礙[1]。這些數(shù)據(jù)表明，BDNF可能是應(yīng)激相關(guān)性認(rèn)知功能障礙的潛在分子機(jī)制。尋找預(yù)防海馬神經(jīng)元損傷和BDNF表達(dá)下降的方法，可能是防治慢性應(yīng)激所致認(rèn)知功能障礙的有效途徑。
　　現(xiàn)在使用較普遍的慢性應(yīng)激動(dòng)物模型主要有:慢性束縛應(yīng)激模型

3、、慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激模型、交流箱模型、社交失敗應(yīng)激動(dòng)物模型、空瓶刺激情緒應(yīng)激模型等[2-5]。其中，慢性束縛應(yīng)激模型的制作相對(duì)簡(jiǎn)單，操作方便，是目前使用頻率較高的應(yīng)激模型之一。大量的臨床研究證實(shí)，丹參多酚酸具有多種藥理學(xué)作用，如抗炎、抗氧化、改善循環(huán)、清除自由基和神經(jīng)保護(hù)等作用。本研究擬建立慢性束縛應(yīng)激模型，探討丹參多酚酸對(duì)慢性應(yīng)激導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的改善作用及其對(duì)海馬部位BDNF表達(dá)的影響。
　　方法:采用3月齡健康雄性昆明小

4、鼠，應(yīng)用慢性束縛方法建立慢性應(yīng)激模型。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為以下3組(n=14):
　　(1)空白對(duì)照組(control):小鼠不做應(yīng)激處理，每日腹腔注射生理鹽水（10ml/kg）。
　　(2)慢性束縛應(yīng)激組(stress):小鼠每日腹腔給予生理鹽水(10ml/kg)，然后束縛制動(dòng)8h(9:00-17:00)。
　　(3)慢性束縛應(yīng)激+丹參多酚酸組(stress+sal):小鼠每日腹腔給予丹參多酚酸注射液（10ml/kg）

5、，然后束縛制動(dòng)8h(9:00-17:00)。
　　造模為期14天，造模第1、7、14天稱量小鼠體重。造模14天末通過(guò)新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)(NORT)檢測(cè)其學(xué)習(xí)記憶能力的改變。待行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取材，采用HE染色法觀察海馬神經(jīng)元損傷情況。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)海馬BDNF mRNA表達(dá)。免疫組化法測(cè)定海馬BDNF的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、小鼠體重的改變
　　造模第1、7、14天稱量

6、小鼠體重(g)，小鼠體重增長(zhǎng)量(g)=造模第14天小鼠體重(g)-造模第1天小鼠體重(g)。
　　結(jié)果顯示:造模第1天，對(duì)照組小鼠體重為40.50±2.66。與對(duì)照組相比，stress組的小鼠體重(39.78±2.71)和stress+sal組的小鼠體重（38.93±1.50）無(wú)顯著性差異。
　　造模第7天，對(duì)照組小鼠體重為47.03±2.40。與對(duì)照組相比，stress組的小鼠體重（42.30±2.93）和stress+s

7、al組的小鼠體重（40.64±3.33）均顯著下降(P＜0.01)。
　　造模第14天，對(duì)照組小鼠體重為48.53±3.01。與對(duì)照組相比，stress組的小鼠體重（43.61±3.92）和stress+sal組的小鼠體重(42.69±2.35)均顯著下降(P＜0.01)。
　　對(duì)照組小鼠體重增長(zhǎng)量為8.01±2.12。與對(duì)照組相比，stress組的小鼠體重增長(zhǎng)量（3.84±1.40）和stress+sal組的小鼠體重增長(zhǎng)量

8、(3.84±1.40)均顯著下降(P＜0.01)。
　　以上結(jié)果表明，造模14天三組小鼠體重均較基線有所增長(zhǎng);但不論是否用藥，應(yīng)激小鼠的體重增長(zhǎng)量都比對(duì)照組小鼠小。
　　2、小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變
　　造模14天末，開(kāi)始對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行新異物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)(NORT)測(cè)試，采用探索物體的時(shí)間(s)和新異物體的差異指數(shù)作為學(xué)習(xí)記憶的檢測(cè)指標(biāo)。新異物體差異指數(shù)(DR)=探索新物體的時(shí)間/（探索新物體的時(shí)間+探索舊物體的時(shí)間）。<

9、br>　　結(jié)果顯示:在熟悉期，對(duì)照組小鼠對(duì)物體A的探索時(shí)間（18.39±2.22）和對(duì)物體B的探索時(shí)間（19.26±2.41）沒(méi)有顯著性差異;stress組小鼠對(duì)物體A的探索時(shí)間（19.60±2.29）和對(duì)物體B的探索時(shí)間（18.89±2.58）沒(méi)有顯著性差異;stress+sal組小鼠對(duì)物體A的探索時(shí)間(17.17±2.67)和對(duì)物體B的探索時(shí)間(17.59±2.70)沒(méi)有顯著性差異。
　　在識(shí)別期，對(duì)照組對(duì)新物體的探索時(shí)間為1

10、9.64±2.04，stress+sal組對(duì)新物體的探索時(shí)間為17.76±2.76。與對(duì)照組和stress+sal相比，stress組對(duì)新物體的探索時(shí)間（11.86±2.42）顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)和stress+sal組(P＜0.05)。
　　對(duì)照組DR為0.53±0.14。stress+sal組DR為0.52±0.12。與對(duì)照組和stress+sal相比，stress組DR(0.41±0.t3)顯著低于對(duì)照組(P＜0.

11、05)和stress+sal組(P＜0.05)。
　　以上結(jié)果表明，慢性應(yīng)激后小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降。而給予丹參多酚酸干預(yù)后，能改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
　　3、小鼠海馬的組織病理學(xué)改變
　　HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠海馬區(qū)細(xì)胞排列整齊有序，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，形態(tài)完整，胞漿豐富，胞核飽滿，核仁清晰，核染色質(zhì)均勻未見(jiàn)明顯變化。
　　與此相比，應(yīng)激組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞體積縮小或近似正常，部分神經(jīng)元細(xì)胞呈泡狀

12、改變，有少量凋亡小體形成，胞質(zhì)濃縮，胞核不規(guī)則。丹參多酚酸干預(yù)組可見(jiàn)到核輕度不規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)接近于對(duì)照組神經(jīng)元。
　　4、小鼠海馬BDNF mRNA的改變
　　采用real-time PCR法檢測(cè)海馬部位BDNF mRNA的表達(dá)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算出各樣品中目的基因的相對(duì)表達(dá)量。
　　對(duì)照組的目的基因的相對(duì)表達(dá)量為0.56±0.13，stress+sal組的目的基因的相對(duì)表達(dá)量為0.55±0.19。stress組的

13、目的基因相對(duì)表達(dá)量（0.32±0.11）顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)和stress+sal組（P＜0.05）。
　　以上結(jié)果表明，慢性應(yīng)激小鼠海馬BDNF mRNA表達(dá)顯著下降，丹參多酚酸能改善應(yīng)激后海馬BDNF基因的下調(diào)。
　　5、小鼠海馬BDNF蛋白的改變
　　采用免疫組化法檢測(cè)海馬部位BDNF蛋白的表達(dá)。計(jì)數(shù)各組海馬部位BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)變化。
　　對(duì)照組BDNF陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為36.08±0.7，stres