人Il-37重組蛋白的表達(dá)純化及體外生物學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、人白細(xì)胞介素-37(Interleukin-37，IL-37)屬于IL-1家族，處于人類2號(hào)染色體的IL-1家族基因簇上。IL-37是已知為數(shù)不多的具有炎癥抑制功能的細(xì)胞因子之一，其表達(dá)水平的變化與多種炎癥及免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。有關(guān)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)患者IL-37表達(dá)水平研究顯示，與正常對(duì)照比較，SLE患者血清IL-37水平明顯增高。另有研究發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患

2、者的血漿IL-37表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照。除此之外，Boraschi等人發(fā)現(xiàn)IL-37在人冠脈和頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的泡沫細(xì)胞中高表達(dá)，揭示在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的進(jìn)展中IL-37可能充當(dāng)一定角色。此外，最近的一系列研究發(fā)現(xiàn)IL-37蛋白或mRNA的表達(dá)水平增高與炎癥性腸病、格林巴利綜合征、慢性乙肝、病態(tài)肥胖、甲狀腺功能亢進(jìn)和強(qiáng)制性脊柱炎的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)。值得注意的是，近期一項(xiàng)針對(duì)人免疫缺陷病毒(Human immunodeficien

3、cyvirus1，HIV-1)感染人群的隊(duì)列研究表示，與正常人外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中IL-37 mRNA水平相比，HIV感染者PBMCs中穩(wěn)態(tài)IL-37 mRNA表達(dá)水平明顯升高。此外，HIV-1感染者血漿中單核細(xì)胞炎性標(biāo)記物sCD14表達(dá)水平與其PBMC中IL-37 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。此項(xiàng)研究還觀察到HIV儲(chǔ)存庫(PBMCs中總HIV-1DNA)與P

4、BMC中IL-37mRNA表達(dá)水平具有顯著相關(guān)性。
　　目的：
　　1.比較HIV感染者與正常人群血漿IL-37、IP-10等細(xì)胞因子表達(dá)水平差異，分析HIV感染者血漿IL-37表達(dá)水平與外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)量及外周血HIV RNA的相關(guān)性;
　　2.構(gòu)建人IL-37原核表達(dá)載體，對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并建立IL-37原核重組蛋白純化技術(shù)，并在分子和細(xì)胞水平鑒定IL-37重組蛋白的部分生物學(xué)性質(zhì)，包括:IL-37重組蛋白是

5、否能夠抑制THP-1/A549細(xì)胞對(duì)炎癥刺激因子的應(yīng)答;IL-37重組蛋白是否保留與其受體IL-18Rα特異性結(jié)合的能力，為利用動(dòng)物疾病模型研究IL-37的炎癥抑制功能奠定一定的基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測(cè)定HIV感染者及健康對(duì)照人群血漿中IL-37、IL-10、IP-10:將特異性識(shí)別各細(xì)胞因子的捕獲抗體包被到酶標(biāo)板上，4℃孵

6、育過夜;洗板3次后加入封閉液，室溫孵育1h;血漿以(原液∶PBS)1∶2稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品按說明書稀釋到不同濃度，各加入酶標(biāo)板不同孔洞中，以稀釋液作為空白對(duì)照，然后室溫孵育2h;總計(jì)洗板5次后加入檢測(cè)工作液（檢測(cè)抗體和HRP標(biāo)記的二抗），隨后室溫孵育1h;總計(jì)洗板7次后加入顯色底物，置于室溫孵育30min，然后加入終止液結(jié)束反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測(cè)后分析結(jié)果。
　　2.IL-37變體重組蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)以及純

7、化操作:通過PCR從pCDH-hIL-37-T2A-copGFP載體上擴(kuò)增出人IL-37的基因，使用pET-19b質(zhì)粒，構(gòu)建IL-37的原核表達(dá)載體，并在E.coli BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)N端帶有6個(gè)組蛋白(His6)標(biāo)簽的融合蛋白，利用鎳離子親和層析柱純化得到IL-37的重組蛋白，并使用SDS-PAGE和Western Blot（使用Anti-His和Anti-IL37單克隆抗體）對(duì)重組蛋白進(jìn)行鑒定，并對(duì)IL-37進(jìn)

8、行部分生物學(xué)功能分析。
　　結(jié)果：
　　1.本研究比較了HIV感染者和正常人群血漿IP-10、IL-10和IL-37表達(dá)水平，結(jié)果顯示:HIV感染者血漿中IP-10和IL-37表達(dá)水平顯著高于正常人群，而IL-10在HIV感染者和正常人群中無明顯差異;對(duì)HIV感染者IP-10、IL-10和IL-37水平與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)作相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血漿中IP-10、IL-10和IL-37水平與CD4計(jì)數(shù)均不具有明顯相關(guān)性。
　

9、　2.本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了E.coli重組表達(dá)載體pET-19b-His6-hIL-37:在E.coli中實(shí)現(xiàn)了IL-37的高效誘導(dǎo)表達(dá)，初步建立了IL-37蛋白純化工藝，利用該工藝路線我們從細(xì)菌誘導(dǎo)物中獲得高純度的IL-37蛋白。進(jìn)行IL-37相關(guān)功能分析表明，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入一定量的IL-37重組蛋白后，使用LPS和IL-1β分別刺激人巨噬細(xì)胞系THP-1細(xì)胞和人肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞，炎癥因子IL-6的表達(dá)水平受到一定程度抑制，且我們