銅綠假單胞菌dsbM基因?qū)Π被擒疹惪股啬退幮缘恼{(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、銅綠假單胞菌在臨床上常常會(huì)引起長(zhǎng)時(shí)間無法醫(yī)治和好轉(zhuǎn)的感染。它是一種很重要的致病菌，銅綠假單胞菌的眾多毒力因子產(chǎn)生和存在是其具有感染性和致病性的重要因素。隨著生命醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，抗生素藥物在臨床中的應(yīng)用變得越來越多，細(xì)菌多重耐藥性的出現(xiàn)給醫(yī)院治療疾病帶來了非常大的困難，其中銅綠假單胞菌是臨床疾病感染細(xì)菌重要種類之一。因此，對(duì)其耐藥性機(jī)理的研究就顯得尤為重要。
　　本文以一株臨床分離出來的卡那霉素敏感株P(guān).aeruginosa PA6

2、8為研究對(duì)象，對(duì)dsbM、PA0056、PA0057、oxyR等抗性相關(guān)基因進(jìn)行探索，其中前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)dsbM基因編碼的蛋白是一種新型的二硫鍵氧化還原酶；PA0056為一個(gè)功能未知的新基因，屬于LysR家族調(diào)控因子；通過Blast比對(duì)，PA0057所編碼的蛋白為一種金屬β-內(nèi)酰胺酶，能夠水解β-內(nèi)酰胺類抗生素；oxyR基因目前研究較為廣泛，它與PA0056基因同屬于LysR家族，oxyR調(diào)節(jié)子的下游是參與過氧化代謝和保護(hù)的基因（ka

3、tG、ahpC、ahpF、dps等）、氧化還原平衡基因（gor、grxA、trxC等）、重要的調(diào)控因子和小分子RNA oxyS等。
　　對(duì)PA68-Δ0056突變株的表型進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種氨基糖苷類抗生素的耐藥性都得到增強(qiáng)。通過同源重組實(shí)驗(yàn)，在模式菌株P(guān).aeruginosa PAK中敲除dsbM基因，得到的基因敲除株與PA68-Δ0056的抗生素表型趨勢(shì)一致，證實(shí)了PA0056基因在模式菌株中同樣能夠影響氨基糖苷類抗生素的耐

4、藥性。通過遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)導(dǎo)入攜帶完整PA0056基因的表達(dá)載體，可以使突變株P(guān)A68-Δ0056和PAK-Δ0056對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥性降低，表型向野生型恢復(fù)。
　　銅綠假單胞菌PA0057基因?yàn)棰纛愇粗?，通過比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PA0057基因編碼的蛋白與金屬β-內(nèi)酰胺酶同源性為96％，因此推測(cè)PA0057蛋白可能具有金屬β-內(nèi)酰胺酶活性。提取銅綠假單胞菌PAO1基因組DNA，利用設(shè)計(jì)的引物通過PCR方法擴(kuò)增得到PA0057基因，將

5、其克隆至克隆載體pGEM-T，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α；而后將其克隆至表達(dá)載體pET28a中，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并通過Ni-NTA親和柱進(jìn)行純化，純化后蛋白超濾濃縮得高濃度蛋白；通過藥敏紙片檢測(cè)PA0057蛋白金屬β-內(nèi)酰胺酶活性。本文對(duì)PA0056、oxyR基因進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，并利用其表達(dá)產(chǎn)物與DsbM蛋白進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DsbM蛋白能夠催化PA0056和OxyR蛋白的二硫鍵氧化還原，從而改變

6、其氧化還原型狀態(tài)而影響下游抗氧化基因。此外，PA0056半胱氨酸的突變使得DsbM與PA0056蛋白之間的相互作用消失，體外氧化還原實(shí)驗(yàn)中DsbM的催化作用也消失了，這就說明DsbM與OxyR、PA0056蛋白之間的作用是依賴于二硫鍵的形成。
　　通過對(duì)PA0056啟動(dòng)子的分析，我們發(fā)現(xiàn)其能和PA0056蛋白結(jié)合，將啟動(dòng)子P0056連報(bào)告基因后，轉(zhuǎn)化入PA68-Δ0056和M122后的β-半乳糖苷酶活性比轉(zhuǎn)入PA68后分別變化了8