中性微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡用于基因轉(zhuǎn)染實驗研究.pdf

1、第一部分.中性微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡制備及性能檢測
　　第一節(jié):中性微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡制備及基本物理特征檢測
　　目的:構(gòu)建中性微泡（NMB）、陽離子微泡（CMB）及靶向陽離子微泡（CMB105），并檢測其基本物理特征。
　　方法:采用機(jī)械震蕩法構(gòu)建三種不同脂質(zhì)微泡，通過在成膜材料中加入DC-膽固醇（DC-cholesterol）使微泡表面帶正電荷從而構(gòu)建陽離子微泡（CMB），通過“生物素-親和

2、素”橋接法構(gòu)建攜抗CD105抗體的靶向陽離子微泡(CMB105)，并同時構(gòu)建攜同型對照抗體微泡(C-CMB105)，光鏡下觀察不同微泡基本形態(tài)，激光共聚焦顯微鏡證實抗體連接，并檢測其濃度、粒徑和表面電位等基本特性。健康裸鼠尾靜脈注射不同類型微泡，檢測其體內(nèi)循環(huán)特征。
　　結(jié)果: NMB、CMB、CMB105及C-CMB105均成功構(gòu)建，光鏡下大小均一，分散度較好，激光共聚焦顯微鏡下鏈接經(jīng)FITC標(biāo)記二抗后的CMB105及C-CMB

3、105顯綠色熒光；CMB和CMB105的表面電位分別為26.44±2.13和26.62±2.48mV，而NMB表面電位為-2.38±0.56mV，呈微弱負(fù)電荷。CMB, C-CMB105和CMB105的半衰期分別為8.35±1.27,7.63±1.61和7.27±1.33min，而NMB的半衰期長于20min。
　　結(jié)論: NMB、CMB及CMB105構(gòu)建成功，表面連接抗體并不影響微泡表面電位及粒徑。CMB和CMB105由于其表面

4、帶正電荷，體內(nèi)半衰期時間短于NMB。
　　第二節(jié):中性微泡、陽離子微泡、靶向陽離子微泡體外及體內(nèi)靶向能力檢測
　　目的:檢測NMB、CMB、及CMB105體外及體內(nèi)靶向表達(dá)CD105抗原的血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力。
　　方法:第一部分采用自行設(shè)計的特殊裝置，將生長有臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的玻片先倒置與微泡充分孵育，再將其正置，倒置顯微鏡下計數(shù)與HUVECs靶向結(jié)合微泡數(shù)，檢測不同微泡體外靶向的能力。第二部分皮下注射乳

5、腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株，建立人乳腺癌裸鼠模型,病理切片證實CD105表達(dá)于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。不同類型微泡經(jīng)尾靜脈注射，通過超聲腫瘤成像，檢測其體內(nèi)靶向腫瘤新生血管能力。兩部分實驗中，C-CMB105作為CMB105同型對照而納入實驗分組中，競爭抑制實驗被用于證實CMB105與靶細(xì)胞的特異性結(jié)合。
　　結(jié)果:體外實驗中，除NMB之外，CMB、CMB105及C-CMB105均可與表達(dá)CD105抗原的HUVECs結(jié)合，而CM

6、B105與HUVECs靶向結(jié)合數(shù)量最高（P＜0.01），預(yù)先加入CD105抗體孵育后，CMB105靶向細(xì)胞數(shù)目明顯降低（P＜0.01），而預(yù)先與同型對照抗體孵育時卻沒有影響（P＞0.05）。體內(nèi)實驗中，除CMB105之外，NMB、CMB及C-CMB105均不能靶向表達(dá)CD105抗原的腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。預(yù)先靜脈注射抗CD105抗體后，與腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞靶向結(jié)合的CMB105顯著降低（P＜0.001）
　　結(jié)論: CMB、CM

7、B105及C-CMB105均可與表達(dá)CD105抗原的HUVECs結(jié)合，但只有CMB105能與HUVECs靶向結(jié)合，而CMB與C-CMB105與HUVECs結(jié)合是通過細(xì)胞與帶正電荷的微泡之間的電偶配對作用，這一優(yōu)勢在體內(nèi)實驗中不復(fù)存在，充分證實了CMB105主動靶向的能力。
　　第二部分.中性微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡體外轉(zhuǎn)染HUVECs實驗研究
　　第一節(jié):中性微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡基因攜載能力及超聲轉(zhuǎn)染后對

8、HUVECs活性影響實驗研究
　　目的:研究NMB、CMB、CMB105攜載內(nèi)皮抑素質(zhì)粒（ES-GFP）能力及超聲作用后對HUVECs活性影響。
　　方法:第一部分?jǐn)U增抽提內(nèi)皮抑素質(zhì)粒（ES-GFP）并鑒定，將不同量(10,20,40, and80μg)的質(zhì)粒與微泡（5×108個）進(jìn)行孵育，利用靜電吸附原理使其充分結(jié)合，15分鐘后離心洗滌，通過檢測未結(jié)合的質(zhì)粒量來計算與微泡結(jié)合的質(zhì)粒量，并得出不同微泡質(zhì)粒攜載能力。第二部分是

9、在超聲作用下破壞NMB、CMB、CMB105，設(shè)空白組作為對照，通過FDA/PI雙染色即時觀察對細(xì)胞膜通透性影響，均為陽性則表示細(xì)胞膜通透性打開而同時細(xì)胞活性未受影響，并進(jìn)一步行MTT檢測，觀察對細(xì)胞增殖活性影響。
　　結(jié)果:NMB、CMB、CMB105攜載ES-GFP的能力分別是0.48±0.04μg,18.21±1.22μg和16.76±1.75μg（per5×108microbubbles），CMB和CMB105的基因攜載量

10、無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。FDA+/PI+陽性率在CMB105組最高（36.89±4.28％），與空白組（0.121±0.013%）、NMB組(6.19±2.35%)和 CMB組(28.12±3.58%)相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）?？瞻捉M、NMB組、CMB組、CMB105組各組細(xì)胞增殖活性分別為92.45±2.74%，90.63±2.52%，84.29±5.07%，77.38±5.33%，CMB組、CMB105組細(xì)胞增殖

11、活性降低，組間比較差異亦具統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:由于表面帶正電荷，CMB和CMB105基因攜載能力明顯提高，而表面攜帶抗體并不影響CMB105基因攜載能力；與細(xì)胞結(jié)合微泡數(shù)量越多，其細(xì)胞膜通透性增加愈明顯，而同時細(xì)胞增殖活性降低。
　　第二節(jié):中性微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡攜內(nèi)皮抑素質(zhì)粒超聲作用下轉(zhuǎn)染HUVECs的實驗研究
　　目的:研究NMB、CMB、CMB105攜內(nèi)皮抑素質(zhì)粒在超聲作用下轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞

12、轉(zhuǎn)染效率，以及對細(xì)胞周期、體外血管成型及腫瘤細(xì)胞侵襲的影響。
　　方法:實驗分空白組、NMB組、CMB組、CMB105組四組，超聲（1MHz,1W/cm2,and50%duty cycle(DC),30seconds）作用下轉(zhuǎn)染HUVECs，轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞行流式細(xì)胞檢測轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞周期，qPCR及Western-blot分別檢測Endostatin、VEGF、Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)情況。通過體外血管成型及MDA-

13、MB-231細(xì)胞侵襲評價ES質(zhì)粒在不同微泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)染后治療效果。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染后24小時各組轉(zhuǎn)染效率分別為0.22±0.02%，1.36±0.13%，22.87±1.64%，33.60±2.02%，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；轉(zhuǎn)染后24小時即可觀察到在CMB和CMB105組，細(xì)胞周期抑制于G1期，48小時細(xì)胞周期抑制更加明顯，CMB和CMB105組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；qPCR和 Western-bl

14、ot均檢測到在CMB和CMB105組Endostatin和Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)增加，而VEGF mRNA及蛋白表達(dá)下降，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在血管成型及腫瘤細(xì)胞侵襲實驗中，各組血管官腔形成數(shù)目分別為：22.33±3.082、21.05±3.120、14.33±2.150、6.33±2.520，遷移腫瘤細(xì)胞數(shù)目分別為：67.33±5.06、64.72±5.38、34.33±3.22、25.17±2.

15、84。
　　結(jié)論:CMB和CMB105組較對照組和NMB組轉(zhuǎn)染效率明顯提高，但CMB105組具有更高的轉(zhuǎn)染效率及生物學(xué)效應(yīng)，可明顯抑制體外血管成型以及腫瘤細(xì)胞侵襲。
　　第三部分.中性微泡、陽離子微泡及靶向陽離子微泡轉(zhuǎn)染治療乳腺癌種植瘤實驗研究
　　目的:研究NMB、CMB、CMB105攜 ES質(zhì)粒在超聲作用下轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠種植瘤，觀察其對腫瘤模型生長的影響及治療作用。
　　方法:雙后肢皮下注射

16、MDA-MB-231細(xì)胞懸液建立種植瘤模型，造模后14天，NMB、CMB、CMB105攜ES質(zhì)粒在超聲（1MHz,2W/cm2,and50%DC,30seconds）作用下轉(zhuǎn)染腫瘤，左側(cè)腫瘤接受治療，右側(cè)腫瘤做為對照。治療前及治療后每3天觀察記錄腫瘤生長情況，治療后15天處死動物，剝?nèi)∧[瘤計算抑瘤率，行TUNEL及PCNA觀察腫瘤細(xì)胞凋亡及增殖狀況。
　　結(jié)果:通過繪制腫瘤生長曲線，在轉(zhuǎn)染后12天開始，CMB治療組及CMB105治

17、療組腫瘤生長均受到抑制，轉(zhuǎn)染后15天，NMB、CMB及CMB105各治療組抑瘤率分別為：10.63±1.47%、27.57±3.02%、53.18±5.69%，CMB105攜帶ES質(zhì)粒在超聲作用下成功抑制腫瘤生長。三組的凋亡指數(shù)分別為：8.217±3.628%、25.06±5.721%、56.643±8.534%，增殖指數(shù)分別為：78.353±8.726%、50.98±6.142%、21.873±4.309%。
　　結(jié)論:攜載ES