MEF2D對DYRK1A基因表達(dá)的調(diào)節(jié).pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 MEF2D對DYRK1A的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　研究目的：
　　研究DYRK1A不同異構(gòu)體在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的特異性表達(dá)情況，以及MEF2D對DYRK1A不同異構(gòu)體的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，明確其分子調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)一步探索MEF2D對DYRK1A的調(diào)控作用與神經(jīng)發(fā)育之間的關(guān)系。
　　研究方法：
　　1.在人腦膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞系中研究轉(zhuǎn)錄因子MEF2D對DYRK1A基因不同異構(gòu)體的

2、轉(zhuǎn)錄調(diào)控。應(yīng)用LipofectamineTM2000分別將MEF2D表達(dá)質(zhì)粒pCMV6-entry-MEF2D及空白對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入T98G細(xì)胞，48小時(shí)后將細(xì)胞收集起來，應(yīng)用TRIzol法提取細(xì)胞中的RNA，并使用Takara PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)一步通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測內(nèi)源性DYRK1A mRNA不同異構(gòu)體的表達(dá)變化;應(yīng)用SYBR Green法實(shí)時(shí)熒光定量PCR

3、(Real-time RT-PCR)法再次檢測DYRK1A不同異構(gòu)體的表達(dá)情況并進(jìn)行分析。
　　2.MEF2D對DYRK1A啟動子活性調(diào)控。
　　2.1 DYRK1A啟動子質(zhì)粒的構(gòu)建:利用PCR技術(shù)從提取的人類基因組中擴(kuò)增DYRK1A的啟動子序列，并將其克隆到無啟動子活性的pGL3-Basic載體中，或者啟動子質(zhì)粒pDYluc-long;
　　2.2 MEF2D高表達(dá)及敲除siRNA效果檢測。應(yīng)用Lipofectami

4、neTM2000將MEF2D表達(dá)質(zhì)粒及敲除siRNA分別與空白對照轉(zhuǎn)染入T98G細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集細(xì)胞并裂解，蛋白定量后應(yīng)用Western Blot檢測MEF2D以及DYRK1A的表達(dá)變化，β-ACTIN作為內(nèi)參;
　　2.3 應(yīng)用LipofectamineTM2000將pCMV6-entry-MEF2D及空白對照質(zhì)粒、MEF2D敲除siRNA及空白對照分別與pDYluc-long及pGL3-Basic質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK293

5、細(xì)胞，48小時(shí)后裂解細(xì)胞并應(yīng)用Luciferase Assay技術(shù)檢測啟動子活性。
　　3.尋找并確認(rèn)DYRK1A啟動子功能性DY-MRE(MEF2D responsiveelement)位點(diǎn)。
　　3.1 MEF2D結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測:http://jaspar.genereg.net/網(wǎng)站中輸入DYRK1A啟動子區(qū)序列，預(yù)測MEF2D的可能結(jié)合位點(diǎn);
　　3.2 分別構(gòu)建含有DYRK1A啟動子不同區(qū)域截短體的熒光素酶載體

6、，應(yīng)用LipofectamineTM2000將pCMV6-entry-MEF2D及空白對照質(zhì)粒分別與不同截短體載體及pGL3-Basic質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，48小時(shí)候收集細(xì)胞并裂解，應(yīng)用Luciferase Assay分析不同截短體在MEF2D作用下的啟動子活性變化;
　　3.3 構(gòu)建包含預(yù)測DY-MRE的載體及對應(yīng)的突變載體，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞并通過Luciferase Assay再次確認(rèn)MRE的活性。
　　4.

7、在動物模型中研究MEF2D與DYRK1A之間的關(guān)系。分別取胚胎期為13.5天(E13.5)、18天(E18)及出生后1、7、14天(P0，P7，P14)的多只小鼠的大腦皮層，應(yīng)用TRIzol法提取組織中的RNA，進(jìn)一步應(yīng)用TakaraPrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，結(jié)合SYBR Green法實(shí)時(shí)熒光定量檢測樣本中MEF2D及總DYRK1A的mRNA表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.MEF2D

8、可以特異性上調(diào)DYRK1A的mRNA總量DYRK1A isoform5的表達(dá)量，對DYRK1A isoform2，3的mRNA表達(dá)量并無影響。T98G以及HEK293細(xì)胞中可以檢測到DYRK1A isoform1和5以及MEF2D的蛋白表達(dá)。
　　2.MEF2D通過增強(qiáng)DYRK1A isoform5的啟動子活性上調(diào)DYRK1A mRNA的表達(dá)。
　　2.1 MEF2D高表達(dá)后顯著上調(diào)DYRK1A啟動子活性;
　　2.2

9、 MEF2D被敲減后，DYRK1A啟動子活性與對照相比顯著降低。
　　3.DYRK1A基因啟動子上MEF2D功能性位點(diǎn)DY-MRE的確定。
　　3.1 通過Jaspar網(wǎng)站對DYRK1A啟動子區(qū)域序列進(jìn)行分析，獲得可能的MEF2D結(jié)合位點(diǎn);
　　3.2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測方法檢測DYRK1A啟動子不同區(qū)截短體質(zhì)粒在MEF2D高表達(dá)時(shí)啟動子活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)包含-442～-254 bp位點(diǎn)的啟動子活性可以被MEF2

10、D上調(diào)，通過Jaspar序列分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域包含一個(gè)可能的功能性MEF2D結(jié)合位點(diǎn)，位于-268～-254 bp;
　　3.3 分別構(gòu)建包含-268～-254 bp及對應(yīng)突變的啟動子載體，結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因檢測方法證實(shí)該段區(qū)域啟動子活性可被MEF2D特異性上調(diào)，關(guān)鍵堿基突變后，MEF2D對啟動子活性的上調(diào)作用消失。
　　4.DYRK1A與MEF2D在正常小鼠大腦神經(jīng)發(fā)育過程中mRNA表達(dá)呈正相關(guān)性。當(dāng)MEF2D表達(dá)較高時(shí)

11、，DYRK1A表達(dá)水平也相應(yīng)較高，而當(dāng)MEF2D表達(dá)量較低時(shí)，DYRK1A的表達(dá)量隨之降低，通過斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)計(jì)算證實(shí)p=0.0478，r=0.6182。結(jié)果提示MEF2D與DYRK1A在大腦的神經(jīng)發(fā)育過程中可能存在協(xié)同作用。
　　研究結(jié)論：
　　1.MEF2D可以特異性上調(diào)人DYRK1A isoform5的轉(zhuǎn)錄。
　　2.人DYRK1A基因啟動子活性可被MEF2D上調(diào)，-268～-254 bp處的DYMRE位點(diǎn)可與

12、MEF2D特異性結(jié)合，激活DYRK1A的啟動子活性。
　　3.MEF2D與DYRK1A在正常小鼠的大腦皮層神經(jīng)發(fā)育過程中，mRNA的表達(dá)量呈正相關(guān)性。
　　4.在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，MEF2D通過特異性上調(diào)DYRK1A的表達(dá)降低NFATc2的蛋白表達(dá)量。
　　第二部分 DYRK1A對MEF2D的磷酸化修飾及功能影響
　　研究目的：
　　研究雙底物特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶A(DYRK1A)對轉(zhuǎn)錄因子MEF2

13、D的磷酸化修飾，探尋修飾位點(diǎn)及作用機(jī)制，明確MEF2D磷酸化修飾對其功能的影響。
　　研究方法：
　　1.在人胚腎HEK293細(xì)胞研究DYRK1A對MEF2D的磷酸化作用。應(yīng)用LipofectamineTM2000將pCMV6-entry-MEF2D表達(dá)質(zhì)粒分別與pCMV6-entry-DYRK1A表達(dá)質(zhì)粒及空白對照質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收集并裂解細(xì)胞，應(yīng)用Western Blot檢測MEF2D的表達(dá)情

14、況。
　　2.通過質(zhì)譜檢測，尋找并分析MEF2D蛋白被DYRK1A磷酸化的位點(diǎn)。
　　2.1 構(gòu)建MEF2D的原核表達(dá)載體。MEF2D表達(dá)序列全長521個(gè)氨基酸，將其克隆入pET32a(+)載體中，得到pET32a-MEF2D質(zhì)粒，測序驗(yàn)證其正確表達(dá);
　　2.2 將構(gòu)建好的pET32a-MEF2D轉(zhuǎn)化入感受態(tài)BL21細(xì)胞中進(jìn)行原核擴(kuò)增，并應(yīng)用適當(dāng)濃度的IPTG過夜誘導(dǎo)，收集菌體并進(jìn)行過Ni-NTA柱純化;
　　

15、2.3 對純化后的蛋白進(jìn)行BCA法蛋白定量，并應(yīng)用Western Blotting進(jìn)行檢測，驗(yàn)證其原核表達(dá)的正確性。
　　3.DYRK1A對MEF2D蛋白轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　3.1 將MEF2D特異性識別位點(diǎn)的多拷貝序列(MRE)插入pGL3-Basic載體中，構(gòu)建p3×MRE載體;
　　3.2 應(yīng)用LipofectamineTM2000將DYRK1A表達(dá)載體、DYRK1A激酶失活載體DYRK1A(K188R)及空白

16、對照分別與pGL3-Basic和p3×MRE載體轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中;
　　3.3 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集樣品進(jìn)行Luciferase Assay檢測，并分析檢測結(jié)果。
　　研究結(jié)果：
　　1.DYRK1A過量表達(dá)可以顯著升高外源MEF2D的表達(dá)水平，并使蛋白分子量發(fā)生改變，提示存在化學(xué)修飾。
　　2.純化MEF2D重組蛋白后進(jìn)行體外磷酸化反應(yīng)結(jié)合質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，與空白對照相比，被DYRK1A處理過的MEF2D

17、蛋白樣品，位于251位的絲氨酸存在磷酸化修飾。
　　3.Luciferase Assay結(jié)果顯示，與pGL3-Basic相比，MEF2D可以顯著性升高p3×MRE載體的活性，但DYRK1A會使p3×MRE的活性降低，而失去激酶活性的DYRK1A不會使p3×MRE的活性降低。
　　4.被DYRK1A磷酸化的MEF2D，在NH4Cl的作用下，降解速率顯著降低。
　　研究結(jié)論：
　　1.DYRK1A升高M(jìn)EF2D的表達(dá)