胃癌中CD40信號(hào)調(diào)節(jié)髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)生物學(xué)功能的研究.pdf

1、胃癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，占消化道腫瘤的50％～60%，病死率居各類惡性腫瘤之首，5年生存率只有30%。近年來(lái)發(fā)病率明顯上升，而且越來(lái)越年輕化，但因早期癥狀不明顯，缺乏特異性的初篩指標(biāo)，多數(shù)患者在就診時(shí)已經(jīng)處于進(jìn)展期，傳統(tǒng)根治手術(shù)及放化療對(duì)進(jìn)展期胃癌的療效不理想。因此，迫切需要新的治療方法。免疫治療是目前的研究熱點(diǎn)，啟動(dòng)和建立有效免疫應(yīng)答正成為腫瘤治療的新希望。
　　目前眾多研究發(fā)現(xiàn)一些協(xié)同刺激分子在多種腫瘤中異常表達(dá)。CD

2、40/CD40L是介導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的一對(duì)極其重要的共刺激分子。CD40表達(dá)于淋巴系統(tǒng)的惡性細(xì)胞，癌包括幾乎所有的B細(xì)胞惡性腫瘤，以及許多實(shí)體瘤，例如膀胱癌，腎癌，胰腺癌，胃，乳腺癌，大腸癌，肺癌等。臨床研究表明CD40的表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)聯(lián)。腫瘤細(xì)胞協(xié)同刺激分子的表達(dá)改變，包括正性協(xié)同刺激分子表達(dá)的下降或者突變，以及負(fù)性協(xié)同刺激分子的異常高表達(dá)，導(dǎo)致T細(xì)胞的凋亡及功能抑制，參與了腫瘤免疫逃逸。而腫瘤免疫逃逸通常與髓源性抑制

3、細(xì)胞（myeloid derived suppressorcell，MDSC）的聚集和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cell，Treg）的增多相關(guān)。Treg在維持免疫耐受和破壞抗腫瘤反應(yīng)中扮演重要角色。MDSC通過(guò)誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞產(chǎn)生凋亡、釋放抑制性細(xì)胞因子、誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生以及與NK細(xì)胞和Treg細(xì)胞等形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)而產(chǎn)生負(fù)向調(diào)控功能。其抑制作用主要與精氨酸酶1(arginase-1，ARG1)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(ind

4、ucible nitrieoxidesyntnase，iNos)有關(guān)。已有研究表明MDSC可通過(guò)抑制 T細(xì)胞免疫反應(yīng)以及擴(kuò)增 Treg發(fā)揮其免疫抑制功能的。
　　本研究以CD40為切入點(diǎn)，探討其對(duì)MDSC生物學(xué)功能的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制，為認(rèn)識(shí)MDSC在免疫逃逸中的作用提供有價(jià)值的線索。
　　第一部分：小鼠胃癌模型中MDSC上CD40的表達(dá)及其與腫瘤進(jìn)展的關(guān)系
　　目的：檢測(cè)CD40分別在荷瘤小鼠脾臟來(lái)源和腫瘤浸潤(rùn)的MD

5、SC上的表達(dá)水平，分析其表達(dá)在胃癌進(jìn)展過(guò)程中可能的作用。
　　方法：利用小鼠胃癌細(xì)胞系 MFC皮下注射 C57BL/6j構(gòu)建小鼠胃癌模型。隨著腫瘤進(jìn)展，每隔5天脫頸處死3只模型鼠，剝離腫瘤和脾臟，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤不同進(jìn)展階段脾臟及腫瘤浸潤(rùn)組織中 MDSC比例及其表面 CD40表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其表達(dá)的意義。
　　結(jié)果：與正常小鼠脾臟MDSC相比，荷瘤小鼠脾臟來(lái)源的MDSC表面CD40的表達(dá)明顯上升（P=0.0024）

6、；脾臟MDSC以及腫瘤組織浸潤(rùn)MDSC比例隨著腫瘤生長(zhǎng)逐漸增高；MDSC上CD40表達(dá)水平隨腫瘤進(jìn)展逐漸降低后穩(wěn)定至一定水平。此外，我們尚發(fā)現(xiàn)WildeType(WT)小鼠大約在5～6天成瘤，而CD40-/-小鼠約在7天后成瘤，腫瘤生長(zhǎng)速度和大小明顯小于WT小鼠。隨著腫瘤進(jìn)展，WT小鼠腫瘤浸潤(rùn)性MDSC的累積水平明顯高于 CD40-/-小鼠。上述結(jié)果提示，在小鼠胃癌模型中，腫瘤相關(guān)MDSC表面共刺激分子CD40高表達(dá)，且與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。

7、
　　第二部分：探討CD40對(duì)MDSC生物學(xué)功能的調(diào)控作用
　　目的：以CD40分子為切入點(diǎn)，探討其在調(diào)節(jié)MDSC凋亡、對(duì)T細(xì)胞增殖抑制以及誘導(dǎo)Treg方面的調(diào)控作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：自脾臟分離純化的Gr-1+CD11b+細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度鋪于24孔板。每孔加入2μl GM-CSF后，分別用IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、GM-CSF、IFN-γ、LPS、PEG2和MFC刺激24 h、48h、72h后，

8、收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)CD40在MDSC上的表達(dá)。取經(jīng)磁珠分選獲得的小鼠脾臟MDSC懸液，鋪入96孔板中，對(duì)照組加入PBS，實(shí)驗(yàn)組加入激發(fā)型CD40抗體，5% CO2孵箱培養(yǎng)24 h后，分別離心收集各孔細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析 MDSC細(xì)胞凋亡率。將分選獲得的小鼠脾臟MDSC與CFSE染色T細(xì)胞按照1:3的比例，用anti-CD3和anti-CD28進(jìn)行刺激，72小時(shí)后檢測(cè)CFSE熒光衰減，分析T細(xì)胞增殖情況。將WT小鼠和CD40K

9、O小鼠的脾臟細(xì)胞分離出來(lái)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-4，IL-17，IFN-γ，F(xiàn)oxp3的表達(dá)。
　　結(jié)果：LPS體外刺激MDSC后能夠上調(diào)表面分子CD40的表達(dá)，且在48小時(shí)后，CD40呈進(jìn)一步顯著性上調(diào)。胃癌微環(huán)境下，CD40能夠顯著抑制MDSC的凋亡；而且CD40促進(jìn)MDSC介導(dǎo)的抑制T細(xì)胞增殖功能；CD40參與了MDSC介導(dǎo)的Treg誘導(dǎo)-分化，促進(jìn)Foxp3表達(dá)，增強(qiáng)MDSC免疫抑制功能，在胃癌免疫逃逸中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

10、r>　　第三部分：Genechip分析CD40-/-與CD40low胃癌荷瘤小鼠脾臟細(xì)胞差異基因表達(dá)
　　目的：通過(guò)基因芯片技術(shù)分析CD40-/-與CD40low胃癌荷瘤小鼠脾臟細(xì)胞基因表達(dá)概況，尋找差異表達(dá)基因，分析CD40對(duì)MDSC生物功能作用的可能分子機(jī)制。
　　方法：參照第一部分構(gòu)建胃癌荷瘤小鼠模型，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)1cm后，頸椎脫臼法處死WT荷瘤小鼠與CD40-/-荷瘤小鼠，手術(shù)取出完整的脾臟。經(jīng)150目鋼網(wǎng)研磨，裂紅

11、后，加入1ml Trizol備用。Genechip委托北京博奧生物有限公司進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)CD40-/-和WT小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行全基因組檢測(cè)，尋找差異表達(dá)基因，分析 CD40對(duì) MDSC生物功能作用的可能分子機(jī)制。結(jié)果顯示兩組細(xì)胞基因表達(dá)譜有差異。篩選兩組間差異倍數(shù)（經(jīng)log2轉(zhuǎn)換）2倍以上的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因，篩選出2890個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)593個(gè)，表達(dá)下調(diào)1419個(gè)。Pathway分析結(jié)果顯示