酵母蛋白Doa1（Ufd3）的原核表達、純化、晶體生長及結(jié)構(gòu)生物學研究.pdf

1、泛素.蛋白酶體途徑(ubiquitin.proteasome pathway，I.JPP)參與調(diào)節(jié)細胞周期進程、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、受體胞吞、抗原遞呈、細胞增生與分化以及信號轉(zhuǎn)導等各種細胞生理過程。酵母蛋白Doal(ufd3)屬于PLAA蛋白家族，與泛素蛋白酶體途徑相關聯(lián)，在泛素依賴的蛋白降解途徑中起重要作用，它能與泛素和酵母蛋白Cdc48直接結(jié)合，從而幫助Cdc48招募泛素來行使它的功能。Cdc48(p97/VCP)是分子伴侶AAA.ATP

2、ase家族中的成員之一，在胞內(nèi)行使與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關聯(lián)的降解、膜融合、轉(zhuǎn)錄引子激活等重要功能，而這些功能的行使都與泛素化有關。 本論文擬采用結(jié)構(gòu)生物學方法解析酵母蛋白Doal的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，以期能夠從結(jié)構(gòu)生物學角度闡釋Doal在UPP途徑以及DNA損傷反應當中所起作用的分子機制，為其其它生物學功能的研究奠定結(jié)構(gòu)生物學基礎。 本研究的內(nèi)容包括：運用基因工程技術克隆Doal(ufd3)(320-C)蛋白基因至PET28a和pGEX

3、-6p.1表達載體；運用原核表達系統(tǒng)表達大量可溶性的Doal(1LJfd3)(320-C)片段；運用親和層析、離子交換、分子排阻凝膠層析等手段純化蛋白；通過懸滴氣相擴散法篩選蛋白晶體；通過條件梯度方法優(yōu)化晶體；數(shù)據(jù)收集，解析結(jié)構(gòu)；通過體外GST pull.down實驗驗證相互結(jié)合位點氨基酸。 本研究結(jié)論包括： 1.將酵母蛋白Doal(ufd3)(320-C)的基因片段克隆至pGEX-6P-1和PET28a表達載體；

4、 2.獲得大量高純度的Doal(320-C).6His重組蛋白； 3.篩選得到可用于數(shù)據(jù)收集、結(jié)構(gòu)解析的蛋白晶體； 4.在國內(nèi)外首次得到Doal(Ufd3)(320-C)的晶體結(jié)構(gòu)，最終分辨率為2.0A； 5.通過體外GST pull-down實驗對能夠與Cdc48相互結(jié)合的Doal氨基酸位點進行了初步尋找和探索。 本研究在結(jié)構(gòu)分析的基礎上探究Doal(ufd3)的生物學功能，對Doal(ufd3)與泛