睡眠剝奪差異表達(dá)基因的篩選及生物信息學(xué)分析.pdf

1、睡眠量不正常以及睡眠中出現(xiàn)異常行為，通常表明睡眠和覺(jué)醒正常節(jié)律性交替出現(xiàn)了紊亂。睡眠障礙可由多種因素引起，常與軀體疾病有關(guān)，包括睡眠失調(diào)和異態(tài)睡眠。睡眠與人的健康息息相關(guān)。調(diào)查顯示，很多人都患有睡眠方面的障礙或者和睡眠相關(guān)的疾病，成年人出現(xiàn)睡眠障礙的比例高達(dá)30％。另外，據(jù)中國(guó)6城市的調(diào)研顯示，成年人一年內(nèi)的失眠患病率高達(dá)57％。專家指出睡眠是維持人體生命極其重要的生理功能，對(duì)人體必不可少。長(zhǎng)期失眠會(huì)導(dǎo)致大腦功能紊亂，對(duì)身體造成多種危害

2、，嚴(yán)重影響身心健康。目前國(guó)內(nèi)外大量的研究發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪可以影響某些基因的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的形成，還有可能引發(fā)糖尿病，減少睡眠也有增加抑郁癥的患病風(fēng)險(xiǎn)。
　　隨著人類基因組計(jì)劃的逐步實(shí)施以及分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的快速發(fā)展，越來(lái)越多的動(dòng)植物、微生物基因組序列得以測(cè)定，基因序列數(shù)據(jù)正在以前所未有的速度迅速增長(zhǎng)。然而，如何去研究如此眾多基因在生命過(guò)程中所擔(dān)負(fù)的功能就成了全世界生命科學(xué)工作者共同的課題。為此，建立新型雜交和測(cè)序方法以

3、對(duì)大量的遺傳信息進(jìn)行高效、快速的檢測(cè)、分析就顯得格外重要了?；蛐酒ㄓ址QDNA芯片、生物芯片）技術(shù)就是順應(yīng)這一科學(xué)發(fā)展要求的產(chǎn)物，它的出現(xiàn)為解決此類問(wèn)題指引了方向，并且提供了光輝的前景。由于基因芯片技術(shù)能夠?qū)⒋罅刻结樛瑫r(shí)固定于支持物上，因此可以對(duì)樣品大量序列進(jìn)行一次性的檢測(cè)和分析。正因?yàn)楦鞣N技術(shù)的發(fā)展和革新，解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作繁雜、操作序列數(shù)量少、自動(dòng)化程度低、檢測(cè)效率低等不足的特點(diǎn)。而且，通過(guò)設(shè)計(jì)不同的探針陣列、使用特定

4、的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價(jià)值，如基因表達(dá)譜測(cè)定、突變檢測(cè)、多態(tài)性分析、基因組文庫(kù)作圖及雜交測(cè)序等。
　　近年來(lái)用于蛋白質(zhì)間相互作用研究的先進(jìn)分析技術(shù)包括:酵母雙雜交系統(tǒng)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、表面等離子體共振技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)。但近幾十年來(lái)，隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展，越來(lái)越多的科研工作者開始運(yùn)用生物信息學(xué)的方法來(lái)研究蛋白質(zhì)的相互作用。
　　經(jīng)過(guò)十幾年的快速發(fā)展，生物信息學(xué)已經(jīng)步入了后基因組時(shí)代。生物信息學(xué)的研

5、究?jī)?nèi)容已經(jīng)不再局限于對(duì)基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的高效分析，而是轉(zhuǎn)移到比較基因組學(xué)、代謝網(wǎng)絡(luò)分析、基因表達(dá)譜網(wǎng)絡(luò)分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析以及藥物靶點(diǎn)篩選等方面的研究。目前，生物信息學(xué)已經(jīng)分別與功能基因組、蛋白質(zhì)組、結(jié)構(gòu)基因組等研究領(lǐng)域互相配合、緊密相關(guān)，是目前的系統(tǒng)生物學(xué)研究的研究熱點(diǎn)。
　　生物學(xué)家在揭示一些具有一般規(guī)律的生命現(xiàn)象時(shí)，通常會(huì)選擇某種生物物種作為模式生物，包括它們的生長(zhǎng)特性、一些基因的序列和功能等。模式生物能夠成為科學(xué)

6、研究當(dāng)中不可替代的實(shí)驗(yàn)方案，是由于地球上各種生物許多的基本生命活動(dòng)通常都是保守的。根據(jù)研究者想要解決什么樣的科學(xué)問(wèn)題，才能確定我們選擇什么樣的生物作為模式生物，然后再選擇一些適合這種模式生物的實(shí)驗(yàn)方案。幾十年的研究和發(fā)展，人們就發(fā)現(xiàn)，發(fā)育現(xiàn)象的難題往往可以通常相對(duì)簡(jiǎn)單生物的研究得到解決。因?yàn)檫@些相對(duì)簡(jiǎn)單的生物往往很容易被觀察和進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作。因此，模式生物的研究策略不但可以應(yīng)用于遺傳學(xué)的研究，也可以廣泛的應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)的科學(xué)研究。

7、經(jīng)過(guò)幾十年的科學(xué)研究的經(jīng)驗(yàn)累積，已經(jīng)總結(jié)出了一些典型的模式生物，包括線蟲、果蠅、非洲爪蟾、蠑螈、小鼠等。隨著人類基因組計(jì)劃的完成和后基因組研究時(shí)代的到來(lái)，模式生物研究策略得到了更多的重視?；虻慕Y(jié)構(gòu)和功能可以在其它合適的生物中去研究，同樣人類的生理和病理過(guò)程也可以選擇合適的生物來(lái)模擬。
　　在分類學(xué)上，小鼠屬于哺乳綱、嚙齒目、鼠科、小鼠屬動(dòng)物。小鼠是通過(guò)小家鼠馴化而來(lái)的。它主要分布于世界各地，通常被選擇為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。由于受到人

8、工的長(zhǎng)期飼養(yǎng)和選擇培育，現(xiàn)各大實(shí)驗(yàn)室及生物技術(shù)公司己育成1000多近交系和獨(dú)立的遠(yuǎn)交群。小鼠早在17世紀(jì)就被選擇為研究對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)己成為使用量最大、研究最詳盡的哺乳類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。
　　在20世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展的歷史長(zhǎng)河中，果蠅扮演了極其重要的角色。果蠅作為一種模型生物，一直都表現(xiàn)的非?；钴S，尤其是在遺傳學(xué)的研究和發(fā)育的基因調(diào)控研究方面。另外，各類神經(jīng)疾病的研究、老年癡呆癥、帕金森病、酒精中毒和藥物成癮等也經(jīng)常使用果蠅作為研究對(duì)

9、象，進(jìn)而模擬和推測(cè)人體的生物學(xué)規(guī)律。衰老與長(zhǎng)壽、學(xué)習(xí)記憶與某些認(rèn)知行為的研究等也逐漸開始嘗試用果蠅為模式生物來(lái)展開相關(guān)的科學(xué)研究。
　　本研究主要內(nèi)容分為以下兩個(gè)部分:
　　第一部分:睡眠剝奪對(duì)小鼠海馬體基因表達(dá)的影響及生物信息學(xué)分析
　　本研究首先利用Qlucore Omics Explorer3.0軟件對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)GSE33302差異表達(dá)基因進(jìn)行分析與篩選。Peixoto L等提交的GSE33302芯片數(shù)據(jù)，采用

10、的是商業(yè)化的離子通道芯片平臺(tái)GPL1261，其中9個(gè)樣本來(lái)自睡眠剝奪小鼠海馬體，對(duì)照組數(shù)據(jù)來(lái)自8個(gè)非睡眠剝奪小鼠海馬體。對(duì)GSE33302的數(shù)據(jù)分析篩選出了101個(gè)差異表達(dá)基因，其中下調(diào)基因66個(gè)，上調(diào)調(diào)基因35個(gè)。
　　運(yùn)用PANTHER和DAVID兩種生物學(xué)信息學(xué)工具對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，在生物學(xué)途徑中，睡眠剝奪差異基因主要涉及促性腺激素-釋放激素受體通路、腎上腺素和去腎上腺素生物合成通路、趨化因子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的信

11、號(hào)通路、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路、亨廷頓舞蹈病通路和帕金森病通路等生物學(xué)通路;在生物學(xué)過(guò)程中，差異基因主要涉的生物學(xué)過(guò)程包括及代謝過(guò)程、生物調(diào)節(jié)過(guò)程、發(fā)育過(guò)程、細(xì)胞定位過(guò)程、免疫系統(tǒng)過(guò)程和細(xì)胞凋亡過(guò)程等過(guò)程。
　　最后，利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析軟件STRING對(duì)數(shù)據(jù)集GSE33302中篩選到的差異基因進(jìn)行了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析和計(jì)算，在數(shù)據(jù)集GSE33302篩選到的101個(gè)差異基因中，Usp2、A

12、rmtl、Dbp、Perl、Per2、Cryl、Cry2、Clock、Mapkl、Prkagl、Prkag2、Prkag3、Prkaal、Prkaa2、Prkab2、Eprs、Rars、Xpol、Upf3b、Notchl、Rael、Apoe、Apob、Apoal、Lipc、Hspa5、Sin3a、Hdacl、Jun蛋白與其它≥5個(gè)蛋白存在相互作用關(guān)系，為此蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)。刪除這些節(jié)點(diǎn)蛋白后，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)渙散。因此，這些蛋白在睡眠

13、剝奪相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展中可能起著至關(guān)重要的作用。
　　第二部分:睡眠剝奪對(duì)果蠅大腦基因表達(dá)的影響及生物信息學(xué)分析
　　本研究首先利用Qlucore Omics Explorer3.0軟件對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)GSE4174進(jìn)行了差異表達(dá)基因的分析。Zimmerman等提交的GSE4174芯片數(shù)據(jù)，采用的是商業(yè)化的離子通道芯片平臺(tái)GPL72。選擇其中9個(gè)樣本來(lái)自睡眠剝奪果蠅大腦組織，對(duì)照組數(shù)據(jù)來(lái)自6個(gè)非睡眠剝奪果蠅大腦組織進(jìn)行分析。

14、對(duì)GSE4174的數(shù)據(jù)分析篩選出了171個(gè)差異表達(dá)基因，其中下調(diào)基因125個(gè)，上調(diào)基因46個(gè)。
　　通過(guò)Panther生物學(xué)通路分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因共涉及20個(gè)生物學(xué)通路，其中主要涉及硫胺素代謝途徑、Notch信號(hào)途徑、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)途徑、多巴胺受體調(diào)節(jié)信號(hào)途徑、Wnt信號(hào)途徑、Ras途徑、丙酮酸代謝途徑、嘌呤從頭合成途徑和DNA復(fù)制途徑等。Panther生物學(xué)過(guò)程分析表明，差異基因主要涉及細(xì)胞組成的生物合成過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、細(xì)胞定位過(guò)

15、程、細(xì)胞凋亡過(guò)程、生物調(diào)節(jié)過(guò)程、對(duì)刺激物的反應(yīng)過(guò)程、發(fā)育過(guò)程、多細(xì)胞組織過(guò)程、生物鏈接過(guò)程、代謝過(guò)程和免疫系統(tǒng)過(guò)程等。Panther分子功能分析表明，差異表達(dá)的基因主要涉及轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、酶調(diào)節(jié)活性、催化活性、受體活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、抗氧化活性結(jié)構(gòu)分子活性和結(jié)合活性等。Panther細(xì)胞組成分析表明，差異表達(dá)基因主要包括細(xì)胞膜、細(xì)胞器和高分子復(fù)合物等細(xì)胞成分。
　　最后，利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析軟件ST

16、RING對(duì)數(shù)據(jù)集GSE4174中篩選到的差異基因進(jìn)行了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析和計(jì)算，在數(shù)據(jù)集GSE4174篩選到的171個(gè)差異基因中，brm、DDB1、Ssll、His3.3A、Spt5、Cyck、Hsp83、CG1646、CG6015、CG8258、CG5525、CG1416和CGtgamma蛋白與其它≥5個(gè)蛋白存在相互作用關(guān)系，為此蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)。刪除這些節(jié)點(diǎn)蛋白后，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)渙散。因