NFκB上調(diào)USP16基因的轉(zhuǎn)錄及其分子機制研究.pdf

1、第一部分NFκB上調(diào)USP16基因的轉(zhuǎn)錄及其分子機制研究
　　目的：泛素特異性蛋白酶USP16在基因表達、細胞周期、細胞自我更新和/或衰老過程中起重要作用，且其在唐氏綜合癥中的過度表達是神經(jīng)功能缺損的主要促進者，與神經(jīng)干細胞缺陷密切相關(guān)。但USP16基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本上是未知的。本研究主要探討核轉(zhuǎn)錄因子 NFκB對人USP16基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其分子機制。
　　方法：引物設(shè)計、質(zhì)粒構(gòu)建、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染、熒光素酶活性檢測及分析、

2、核蛋白和ChIP DNA提取、電泳遷移率分析、染色質(zhì)免疫共沉淀、細胞干預、實時定量PCR。
　　結(jié)果：1.成功擴增 USP16基因啟動子區(qū)-1856至+468共2324bp DNA序列，插入載體 pGL4.10構(gòu)建重組熒光素酶報告基因質(zhì)粒pUSP16-A，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建一系列刪切質(zhì)粒。并通過熒光素酶活性檢測得到了一系列正性和負性調(diào)控區(qū)域。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子預測分析發(fā)現(xiàn)人USP16基因啟動子區(qū)-1856至+468含有若干核轉(zhuǎn)錄

3、因子結(jié)合位點，如：NFκB、HIF、SP1。
　　3.根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子預測結(jié)果顯示的結(jié)合位點，依次構(gòu)建4個重組熒光素酶報告基因質(zhì)粒pUSP16-N1～pUSP16-N4。在HEK293細胞中，與空載PMTF相比，共轉(zhuǎn)PMTF-p65質(zhì)粒后熒光素酶活性分別增加2.69，2.51，2.24和2.04倍（P＜0.001），并且對N1 vs. N3, N1 vs. N4以及 N2 vs. N4統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，結(jié)合位點2和3的缺失對NFκB在上調(diào)US

4、P16基因啟動子中的作用有很大的影響。在SH-SY5Y細胞中，得到類似的結(jié)果（P＜0.001）。
　　4.電泳遷移率分析，我們發(fā)現(xiàn)預測到的結(jié)合位點2，3和4在體外可與NFκB p65結(jié)合；而染色質(zhì)免疫共沉淀實驗表明，預測到的結(jié)合位點2和3可與NF?Bp65結(jié)合，而位點1和4不能結(jié)合。
　　6．LPS干預導致SH-SY5Y細胞內(nèi)源性USP16 mRNA水平顯著增加（1.58倍）（P＜0.05），但在HEK293細胞中無顯著影響

5、（數(shù)據(jù)未顯示）。然而，在HEK293細胞和SH-SY5Y細胞中，TNFa干預分別使內(nèi)源性USP16 mRNA的水平增加了1.90倍（P＜0.01）和1.85倍（P＜0.05）。
　　結(jié)論：人 USP16基因的5'側(cè)翼區(qū)，從-1856至+468，具有顯著啟動子活性；過表達NFκB p65可以上調(diào)人USP16啟動子活性；無論在體內(nèi)或體外，有兩個（-826～-815和-510～-501）NF?B p65結(jié)合位點與均可與USP16相互作用

6、；過表達NF?Bp65或LPS和TNFα的刺激活化NFκB均能上調(diào)人類USP16基因的轉(zhuǎn)錄?？傊?，NF?B可通過兩個真正的順式作用元件上調(diào)人USP16基因的轉(zhuǎn)錄。
　　第二部分棉鼠SP-A基因生物信息學分析及其與肺損傷相關(guān)性的研究
　　目的：分析棉鼠肺表面活性相關(guān)蛋白 A（SP-A）基因序列結(jié)構(gòu)和生物信息學特點，觀察棉鼠肺損傷模型中 SP-A mRNA和蛋白表達水平，初探SP-A表達規(guī)律與肺損傷的相關(guān)性。
　　方法：將

7、32只棉鼠隨機均分為4組:3個實驗組棉鼠分別腹腔注射2 mg/kg LPS處理24、48和96 h，對照組腹腔注射等量生理鹽水。建模后提取肺組織總RNA，經(jīng) RT-PCR擴增 SP-A基因，并對其進行生物信息學分析；組織切片觀察LPS作用不同時期肺組織病理學變化；qRT-PCR分析SP-A mRNA水平；蛋白印跡法檢測SP-A蛋白表達。
　　結(jié)果：棉鼠SP-A基因編碼區(qū)長744bp，編碼248個氨基酸，具有多個半胱氨酸保守位點、α

8、螺旋結(jié)構(gòu)和糖基化位點，與其他物種相比其核苷酸（75.4%～90.1%）和氨基酸（70.6%～87.1%）序列均具有較高同源性；在LPS誘導肺損傷模型中發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實驗組肺組織病理學改變隨LPS刺激時間延長而加重，具有時間依賴性；SP-A mRNA和蛋白表達水平在LPS處理24h后開始迅速增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001和P＜0.01），48h時仍持續(xù)上升（P＜0.001和P＜0.01），96h時略有下降，但仍保持在較高水平