細胞增殖的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 非標記蛋白質(zhì)組定量顯示Adar1促進細胞增殖
　　目的：
　　1.應(yīng)用蛋白質(zhì)組學方法分析ADAR1對細胞蛋白表達的影響
　　2.證明ADAR1具有促進細胞增殖的功能
　　方法：
　　1.構(gòu)建表達ADAR1質(zhì)粒
　　把編碼小鼠全長ADAR1氨基酸的cDNA序列克隆到pEGFP-N1載體上，構(gòu)建ADAR1表達質(zhì)粒。用同樣方法把缺少脫氨基酶域的突變ADAR1序

2、列克隆到pEGFP-N1載體上，構(gòu)建對照質(zhì)粒Mutant。
　　2.細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
　　人腎細胞HEK293T被放在改良的高糖培養(yǎng)基DMEM(10％FBS)中，在37℃含有5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DNA轉(zhuǎn)染使用英濰捷基公司的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑完成
　　3.蛋白提取用于細胞外ADAR1活性檢測和蛋白質(zhì)組分析
　　分別轉(zhuǎn)染N1_ADAR1和N1_mutant質(zhì)粒的HEK293T細胞培養(yǎng)

3、48小時后，使用預(yù)冷的帶有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度。
　　4.雙鏈RNA制備和細胞外ADAR1編輯活性測定
　　飛摩爾的雙鏈RNA底物分別加入到混有50微克表達ADAR1細胞蛋白或表達Mutant細胞蛋白的0.5毫升編輯緩沖液中，混勻后在37度孵育2小時。純化編輯后的雙鏈RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA鏈，PCR擴增被編輯的RNA底物，經(jīng)PCR清潔試劑盒純化后測序。
　　5.蛋白溶液內(nèi)胰

4、酶酶解
　　對于定量蛋白質(zhì)組分析，200微克的細胞裂解液加入二硫蘇糖醇(DTT)到20mM摩爾濃度，置于56度還原30分鐘去掉二硫鍵，然后加入碘乙酰胺(IAA)到50mM摩爾濃度，避光置于26度20分鐘，烷基化保護已經(jīng)被還原的二硫鍵。之后加入測序級修飾過的胰酶（1∶50的質(zhì)量比）置于37度消化24小時，消化后的蛋白溶液用10k的超濾管以15000g離心30分鐘超濾得到肽段，超濾過的肽段混合液用ZipTip C18柱子脫鹽純化，然后

5、收集脫鹽純化后的肽段，凍干后放在-20度保存用于進一步分析。
　　6.色譜-二級串聯(lián)質(zhì)譜分析
　　肽段是采用高壓液相色譜(HPLC，Thermo EASY-nLC System)分離和用電噴霧串聯(lián)的混合線性離子井質(zhì)譜儀(Thermo LTQ Orbitrap Velos Elite，Thermo)測定肽段的質(zhì)荷比進行分析。對于每一次分析，樣品先加到C18預(yù)分析柱上，然后通過C18反相分析柱，用線性的溶劑梯度把肽段從C18分析

6、柱上洗脫下來。肽段以陽離子模式進行分析，一級質(zhì)譜使用離子井分析儀以質(zhì)荷比范圍在300-1800之間，分辨率為60，000以圖譜方式獲得。二級質(zhì)譜分析通過誘導碰撞解離模式(CID)完成。以相同方式完成3次重復(fù)樣品的分析。
　　7.數(shù)據(jù)分析和肽段鑒定
　　來源于每個樣品的二級質(zhì)譜(CID)數(shù)據(jù)使用蛋白質(zhì)組分析軟件(ProteomeDiscoverer1.4)以2014年10月21日SWISS-PROT中人的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)進行

7、蛋白搜索鑒定。
　　8.蛋白的非標記定量
　　所有6個樣品質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)使用Progenesis LC-MS軟件（4.1版本;Nonlinear Dynamics，英國）進行非標記蛋白定量分析。定量的統(tǒng)計學分析以ANOVA t test p＜0.05認為有統(tǒng)計學意義，當?shù)鞍棕S度改變小于1.5倍(ADAR1/mutant)時蛋白被拋棄。
　　9.差異表達蛋白的生物信息學分析
　　來自于Progenesis LC-MS

8、軟件分析的ADAR1和Mutant組間差異表達蛋白數(shù)據(jù)，通過著名的PANTHER(http://www.pantherdb.org/)基因聚類軟件分析，得到因ADAR1過表達而調(diào)整的蛋白功能分類的分析結(jié)果;通過著名的STRING(http://www.strin.g-db.org/)蛋白相互作用軟件分析，得到因ADAR1過表達而調(diào)整的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果。
　　10.蛋白Western blot分析
　　Western

9、 blot分析由分別轉(zhuǎn)染ADAR1和Mutant質(zhì)粒的HEK293T細胞提取的蛋白來完成，細胞在冰冷RIPA裂解液中裂解和進行蛋白提取。上樣的50微克蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)到NC膜上，經(jīng)5％牛血清蛋白封閉后孵育一抗、孵育二抗和掃膜，用ImageJ圖像分析軟件進行灰度值分析。
　　11.EDU細胞增殖檢測和MTT細胞增殖檢測
　　結(jié)果：
　　1.HEK293T細胞中ADAR1的表達增加雙鏈RNA編輯活性

10、
　　2.過表達ADAR1改變了HEK293T細胞中的蛋白表達
　　3.ADAR1調(diào)整的差異表達蛋白聚類分析為ADAR1促進細胞增殖提供了分子水平的支持
　　4.ADAR1過表達上調(diào)了蛋白翻譯和細胞周期兩個相互作用網(wǎng)絡(luò)
　　5.ADAR1過表達上調(diào)了PCNA-細胞增殖蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)
　　6.Western blotting分析確認了過表達ADAR1上調(diào)一些與細胞增殖相關(guān)的蛋白
　　7.細胞增殖功能檢

11、驗結(jié)果顯示過表達ADAR1的HEK293T細胞和A549細胞增殖比率增加
　　結(jié)論：
　　1.通過應(yīng)用液相-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)和非標記定量的蛋白質(zhì)組分析，我們認為過表達的ADAR1上調(diào)了基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯、蛋白運輸和細胞周期過程相關(guān)基因，這些被上調(diào)的相關(guān)基因都有利于細胞增殖。
　　2.過表達的ADAR1上調(diào)了蛋白翻譯相互作用網(wǎng)絡(luò)和細胞周期相互作用網(wǎng)絡(luò)，同時過表達的ADAR1上調(diào)了以增殖細胞核抗原(PCNA)為核心的細胞增殖相

12、互作用網(wǎng)絡(luò)，過表達的ADAR1上調(diào)的這三個蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)共同促進了細胞增殖。從而在蛋白分子水平上證明了ADAR1過表達促進細胞增殖。
　　3.兩種方法的細胞增殖功能實驗都證明了過表達的ADAR1能促進HEK293T細胞和A549細胞的細胞增殖比率，在細胞水平上也確定了ADAR1促進細胞增殖的結(jié)果。過表達的ADAR1促進細胞增殖的功能在蛋白質(zhì)組分子水平上和細胞水平上都得到了證明。
　　第二部分 H2A/K假基因突變促進細胞增

13、殖
　　目的：
　　1.驗證突變的H2A/K假基因是有活性的。
　　2.證明突變的H2A/K假基因能夠促進細胞增殖。
　　方法：
　　1.腎癌組織H2A/K長非編碼RNA-cDNA的PCR分析。
　　2.細胞培養(yǎng)、分子克隆和轉(zhuǎn)染。
　　3.蛋白提取。
　　4.蛋白溶液內(nèi)胰酶酶解。
　　5.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。
　　6.組蛋白h2a(無h2a/k)表達蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析。

14、
　　7.應(yīng)用MaxQuant軟件進行蛋白質(zhì)組定量分析。
　　8.差異表達蛋白的生物信息學分析。
　　9.蛋白PCNA的Western blot分析。
　　10.細胞增殖檢測。
　　結(jié)果：
　　1.H2A/K假基因能轉(zhuǎn)錄成長非編碼RNA。
　　2.細胞內(nèi)表達突變H2A/K長非編碼RNA。
　　3.應(yīng)用Shotgun和MaxQuant蛋白質(zhì)組學方法分析突變H2A/K長非編碼NA調(diào)整細胞蛋白表

15、達。
　　4.基因聚類分析顯示突變H2A/K長非編碼RNA促進細胞增殖。
　　5.三個H2A/K突變組中PCNA-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示突變H2A/K長非編碼RNA促進細胞增。
　　6.Western blotting確定PCNA蛋白在三個突變組(M_C290T、M_C228A和M_A45G)細胞中表達上調(diào)。
　　7.細胞增殖功能檢驗顯示突變H2A/K長非編碼RNA(C290T/U、C228A和A45G)促進細

16、胞增殖。
　　討論：
　　1.突變H2A/K長非編碼RNA通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)合蛋白和DEAD-box RNA解旋酶，增加細胞正常的轉(zhuǎn)錄活性從而促進細胞過程和細胞增殖。
　　2.H2A/K假基因雖然不能表達正常組蛋白，但可以轉(zhuǎn)錄成長非編碼RNA。
　　3.我們使用了比較成熟的shotgun質(zhì)譜分析方法和非標記定量蛋白質(zhì)組學方法研究突變H2A/K，分析結(jié)果顯示突變H2A/K長非編碼RNA上調(diào)了許多原癌基因和下調(diào)了一些腫

17、瘤發(fā)生抑制因子。使用生物信息學的基因聚類分析發(fā)現(xiàn)，突變的H2A/K長非編碼RNA上調(diào)許多轉(zhuǎn)錄激活子、翻譯激活子、生物合成過程蛋白和運輸?shù)鞍祝瑥亩龠M細胞過程和細胞增殖。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，在表達突變H2A/K長非編碼RNA的細胞組中，以PCNA為中心的PCNA-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)里，大多數(shù)上調(diào)蛋白是腫瘤發(fā)生相關(guān)基因，這些基因的調(diào)整有利于促進細胞增殖。
　　4.在定量蛋白質(zhì)組的分子水平上和細胞增殖檢測的細胞水平上，都證實了突變的H2A/