RY10-4逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥性及其抗肺腺癌活性研究.pdf

1、黃酮(flavonoids)大量存在于我們的飲食中，有著優(yōu)良的藥理、保健活性于一體的多種功效。它是一種在草本植物當(dāng)中廣泛存在的化合物，對(duì)人類(lèi)的身體健康起著重要的維系作用。黃酮類(lèi)化合物不僅可以從基本的日常生活中去調(diào)節(jié)身體機(jī)能的基本狀態(tài)，還可以預(yù)防腫瘤以及心血管等重大疾病。近年來(lái)隨著科學(xué)水平的深入研究，在臨床治病的角度上來(lái)看，有一些黃酮有著純天然且?guī)缀鯚o(wú)毒性等特點(diǎn)而廣受人們的青睞。
　　普通針毛蕨主要生長(zhǎng)在我國(guó)長(zhǎng)江以南的位置，是一種金

2、星蕨科針毛蕨屬植物。民間古方中普遍認(rèn)為該種草本植物在清熱解毒，散結(jié)軟堅(jiān)方面具有獨(dú)特的功效，因此在傳統(tǒng)祖國(guó)中醫(yī)學(xué)里，它常常被用來(lái)做消除水腫及治療止血之用。這種植物當(dāng)中含有一種特殊的黃酮成分叫做原芹菜素（Protoapigenone）。它在體內(nèi)外的抗癌活性細(xì)胞篩選中均有很好的抗瘤表現(xiàn)。Protoapigenone對(duì)很多不同來(lái)源的癌癥細(xì)胞都能夠表現(xiàn)出很明顯的細(xì)胞毒作用，因此抗腫瘤譜較為全面，這讓廣大科研工作者為之欣喜。在后續(xù)科學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，一

3、系列的非芳香 B環(huán)的黃酮類(lèi)化合物例如原芹菜素都有著強(qiáng)大的抗瘤活性。原芹菜素近幾年在多藥耐藥方面也表現(xiàn)出不俗的成績(jī)，可以有效的治療和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥。
　　根據(jù)構(gòu)效關(guān)系研究及相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，結(jié)合前人對(duì) Protoapigenone的研究基礎(chǔ)，采用化學(xué)全合成的方法合成了毒性更低，藥效更強(qiáng)，含1-hydroxycyclohexa-2,5-dien-4-one基團(tuán)的新型化合物 RY10-4，其化學(xué)名為2-(1-hydroxy-4-ox

4、o-2,5-cyclohexadien-1-yl)-4H-Pyran-4-one。本課題主要對(duì)RY10-4的藥效活性進(jìn)行了深入研究，主要內(nèi)容包括兩個(gè)部分：第一部分主要進(jìn)行了RY10-4體內(nèi)和體外逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的乳腺癌的作用及其所涉及影響的相關(guān)信號(hào)傳遞通路；第二部分主要研究了 RY10-4體外抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲以及誘導(dǎo)凋亡的作用，并對(duì)其抗肺癌活性相關(guān)的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　第一部分：RY10-4體內(nèi)外對(duì)多藥耐藥乳

5、腺癌的殺傷及逆轉(zhuǎn)作用研究
　　目的：本實(shí)驗(yàn)在前期工作中證實(shí)RY10-4在體外可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的凋亡，同時(shí)我們?cè)趯?duì) RY10-4的一個(gè)初步預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，RY10-4作為原芹菜素類(lèi)似物能逆轉(zhuǎn)阿霉素（Adriamycin, ADR）激活的p-AKT，提示其可能和原芹菜素一樣對(duì)阿霉素耐藥的腫瘤細(xì)胞也發(fā)揮抗腫瘤作用，在臨床運(yùn)用上可能具有潛在意義，但RY10-4是否真正具有逆轉(zhuǎn)耐藥作用及可能的作用機(jī)制尚不清楚，因此本部分對(duì)此進(jìn)行著

6、重探討。首先，研究 RY10-4在體外水平對(duì)乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR生長(zhǎng)增殖的影響；其次，進(jìn)一步研究RY10-4對(duì)化療藥物ADR運(yùn)用于MCF-7/ADR細(xì)胞的敏感性及其對(duì)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)功能的改變；然后，我們更進(jìn)一步探討了RY10-4在逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR多藥耐藥時(shí)所涉及的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路；最后，在體內(nèi)水平研究了RY10-4對(duì)耐藥型乳腺癌的抗腫瘤效應(yīng)及逆轉(zhuǎn)作用。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)采用了乳腺癌敏感細(xì)胞系MCF-7和對(duì)阿霉素

7、耐藥的多藥耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR，觀察 RY10-4體內(nèi)和體外抗癌和逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。（1）采用四氮唑鹽還原法（MTT法）繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察RY10-4對(duì)MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；采用Annexin V/PI染色法，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RY10-4對(duì)細(xì)胞MCF-7和MCF-7/ADR凋亡狀態(tài)的改變和影響。（2）采用MTT法體外檢測(cè)RY10-4對(duì)藥物ADR敏感性的分析，探究細(xì)胞MCF-7/ADR在RY10-4作用下對(duì)

8、ADR藥物敏感程度的影響。（3）采用羅丹明（Rhodamine）外排實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞膜在RY10-4作用下的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)泵功能的影響；運(yùn)用Western Blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè) MCF-7/ADR細(xì)胞在 RY10-4作用下細(xì)胞內(nèi) P-gp蛋白表達(dá)水平的改變；運(yùn)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)RY10-4作用后細(xì)胞MCF-7/ADR內(nèi)多藥耐藥基因MDR1的轉(zhuǎn)錄水平的改變。（4）通過(guò)ATP水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，研究RY10-

9、4對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)的P-gp的影響。（5）通過(guò)Western Blot和Real-time PCR等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)RY10-4對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)Akt，p-Akt，NF-κB蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步聯(lián)合使用Akt抑制劑LY294002和NF-κB抑制劑PDTC檢測(cè)對(duì)MDR1基因和P-gp蛋白的影響。（6）運(yùn)用移植瘤模型研究RY10-4體內(nèi)逆轉(zhuǎn)阿霉素的作用并用HE染色研究腫瘤組織的病理學(xué)改變。
　　結(jié)果：RY1

10、0-4具有很強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥作用。（1）細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示,化合物RY10-4對(duì)敏感株MCF-7細(xì)胞及耐藥株MCF-7/ADR細(xì)胞均有生長(zhǎng)抑制作用，和對(duì)照組阿霉素相比，RY10-4可顯著抑制MCF-7/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)；用流式細(xì)胞儀采用Annexin/PI染色法檢測(cè)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，結(jié)果顯示：RY10-4可顯著誘導(dǎo)MCF-7/ADR細(xì)胞的凋亡。（2）MTT法體外分析檢測(cè)乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞對(duì)藥物敏感性影響的結(jié)果顯示：MCF-7/AD

11、R細(xì)胞雖對(duì)ADR耐藥但對(duì)RY10-4的細(xì)胞毒作用敏感，且RY10-4能夠增強(qiáng)MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)化療藥物ADR的敏感性，改變耐藥的狀況。（3）羅丹明123外排實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：RY10-4能夠增高細(xì)胞MCF-7/ADR內(nèi)羅丹明潴留量和蓄積量，提示RY10-4可降低MCF-7/ADR細(xì)胞膜外排泵的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)功能；Western Blot實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)P-gp蛋白，結(jié)果顯示：RY10-4能夠上調(diào)細(xì)胞MCF-7/ADR內(nèi)P-gp蛋白的表達(dá)水平；R

12、eal-time PCR對(duì)MDR1基因的檢測(cè)結(jié)果顯示：RY10-4可以上調(diào)MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)MDR1基因的轉(zhuǎn)錄水平。（4）通過(guò)ATP水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示：RY10-4可以抑制ATP酶活性，降低ATP的水平從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。（5）通過(guò)Western Blot及Real-timePCR方法對(duì)逆轉(zhuǎn)耐藥的相關(guān)信號(hào)通路蛋白檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：RY10-4通過(guò)抑制 PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控MDR/P-gp介導(dǎo)的耐藥型乳腺癌細(xì)胞MCF-7/A

13、DR的多藥耐藥。（6）通過(guò)移植瘤模型發(fā)現(xiàn)：RY10-4可以體內(nèi)逆轉(zhuǎn)耐藥型乳腺癌對(duì)阿霉素的抵抗，不論單用 RY10-4還是聯(lián)用ADR均能使組織中的腫瘤細(xì)胞死亡，表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗癌效應(yīng)和逆轉(zhuǎn)耐藥效力。
　　結(jié)論：RY10-4作為原芹菜素類(lèi)似物，一方面可抑制耐藥的乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，下調(diào) ATP水平并抑制 P-gp的外排功能，另一方面可通過(guò)抑制PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)MDR1/P-gp的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)MCF-7/AD

14、R的多藥耐藥，而且體內(nèi)水平也可以抑制耐藥型乳腺癌腫瘤組織的生長(zhǎng)情況。因此，RY10-4在體內(nèi)水平以及體外水平均表現(xiàn)出抗癌和逆轉(zhuǎn)耐藥的雙重作用。在前期研究中，RY10-4的抗乳腺癌作用雖然已經(jīng)做出了比較深入的研究，但本課題首次報(bào)道并驗(yàn)證了RY10-4具有逆轉(zhuǎn)耐ADR乳腺癌的多藥耐藥作用，首次考察了RY10-4逆轉(zhuǎn)耐藥的分子機(jī)制，并且沒(méi)有明顯的毒副作用，在保證了強(qiáng)大的逆轉(zhuǎn)耐藥作用同時(shí)特保證了其應(yīng)用的安全性，可以說(shuō)RY10-4比傳統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)劑維

15、拉帕米（Verapamil）在逆轉(zhuǎn)多藥耐藥方面有更明顯的優(yōu)勢(shì)。我們的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也提示了兩個(gè)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的潛在靶點(diǎn)：NF-κB及Akt。本實(shí)驗(yàn)的研究?jī)?nèi)容為RY10-4今后在臨床上的抗癌運(yùn)用（與化療藥聯(lián)合使用或者單獨(dú)使用）治療腫瘤多藥耐藥提供了寶貴的指導(dǎo)基礎(chǔ)。
　　第二部分：RY10-4體外抗肺腺癌活性研究
　　目的：本部分在體外水平研究RY10-4化合物抑制人源肺腺癌細(xì)胞A549的增殖作用，探究藥物RY10-4在體外抗肺腺癌

16、的藥效活性，同時(shí)研究其抗肺腺癌藥效活性所涉及的相關(guān)分子機(jī)制及信號(hào)通路。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)選用人肺腺癌細(xì)胞株 A549，觀察 RY10-4體外抗肺癌作用。（1）運(yùn)用MTT法和臺(tái)盼藍(lán)拒染法研究RY10-4抑制A549細(xì)胞體外增殖的作用。（2）運(yùn)用Annexin V/PI雙染法并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)、Hoechst33258熒光染色法，同時(shí)研究RY10-4對(duì)誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的作用。（3）通過(guò) PI染色法流式細(xì)胞儀分析 RY10

17、-4對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用。（4）通過(guò) Transwell法來(lái)評(píng)價(jià) RY10-4對(duì)A549細(xì)胞體外侵襲能力的影響。（5）運(yùn)用Western Blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)RY10-4對(duì)凋亡侵襲相關(guān)蛋白及相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平的影響。（6）用流式細(xì)胞儀檢測(cè)RY10-4對(duì)活性氧自由基（ROS）的影響。
　　結(jié)果：RY10-4在體外表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗肺腺癌活性。（1）RY10-4可以顯著抑制A549細(xì)胞體外增殖活性。（2）RY10-4可以顯著誘導(dǎo) A54

18、9細(xì)胞凋亡，染色法中經(jīng)過(guò)RY10-4處理過(guò)的細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征，凋亡細(xì)胞比率增高，且經(jīng)STAT3抑制劑AG490預(yù)處理可以顯著促進(jìn)RY10-4誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)。（3）RY10-4處理后，細(xì)胞的G1期細(xì)胞比率顯著增加。（4）當(dāng)A549細(xì)胞使用不同濃度RY10-4干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，能夠透過(guò)聚碳酸酯膜的細(xì)胞也梯度性減少，說(shuō)明A549的侵襲行為受到了RY10-4的明顯抑制。（5）在RY10-4處理后的A549細(xì)胞中我們檢測(cè)到，線粒體中的

19、細(xì)胞色素 C向胞漿位置釋放，線粒體凋亡途徑被激活，P38、ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路被磷酸化活化。A549細(xì)胞被抑制劑預(yù)處理后，則發(fā)現(xiàn)U0126（ERK特異性抑制劑）及AG490（STAT3特異性抑制劑）明顯地能夠促進(jìn)化合物RY10-4所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而 SB203580（P38特異性抑制劑）則抑制了 RY10-4誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)。（6）RY10-4處理后可顯著增高ROS水平，且與U0126及AG490聯(lián)用可進(jìn)一步協(xié)同增高ROS水平，而聯(lián)用