聚丁二炔生物傳感器快速檢測(cè)大腸埃希菌O157-H7的研究.pdf

1、目的：
　　 通過(guò)分析聚丁二炔納米材料的物化特性，制備聚丁二炔納米囊泡；對(duì)已有的E.coliO157:H7脂多糖特異性適配體進(jìn)行截短設(shè)計(jì)，研究其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系；采用碳化二亞胺法介導(dǎo)氨基化適配體修飾到聚丁二炔納米囊泡表面，利用該組裝的適配體生物傳感器與E.coliO157:H7反應(yīng)前后的顏色變化實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。
　　 方法：
　　 1、聚丁二炔納米囊泡的制備與表征：以PCDA單體、DMPC和E.coliO157:H7

2、脂多糖(LPS)為膜材，采用探頭超聲法制備三種不同體系的聚丁二炔納米囊泡，分別是純PDA囊泡、PDA/DMPC混合磷脂囊泡以及PDA/DMPC/LPS混合磷脂囊泡。采用透射電鏡負(fù)染技術(shù)，對(duì)這三種囊泡進(jìn)行形貌表征；采用紫外-可見(jiàn)光吸收光譜技術(shù)，對(duì)這三種囊泡進(jìn)行特征吸收峰表征；采用鱟試驗(yàn)，對(duì)LPS是否插入囊泡及插入方向進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 2、EcoliO157:H7脂多糖特異性適配體的截短設(shè)計(jì)與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：對(duì)文獻(xiàn)已報(bào)道的特異性適配體進(jìn)行

3、截短設(shè)計(jì)，分析其序列、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系；通過(guò)ELISA方法和激光共聚焦顯微鏡對(duì)適配體與E.coliO157:H7的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，從而獲得E.coliO157:H7親和力高、特異性強(qiáng)的功能分子。
　　 3、適配體-聚丁二炔納米生物傳感器的組裝、穩(wěn)定性評(píng)價(jià)與結(jié)合實(shí)驗(yàn)：將截短后的適配體進(jìn)行5＇端氨基修飾，通過(guò)酰胺化反應(yīng)固定于納米囊泡表面，實(shí)現(xiàn)生物傳感器的功能化組裝；在不同常用溶液、不同溫度等條件下對(duì)傳感器的穩(wěn)定性做出評(píng)價(jià)；采用透射電

4、鏡驗(yàn)證適配體-聚丁二炔囊泡與脂多糖的結(jié)合程度。
　　 4、大腸埃希菌O157:H7的快速檢測(cè)：利用適配體與E.coliO157:H7特異性結(jié)合所引起的聚丁二炔納米囊泡溶液顏色變化和比色響應(yīng)值(CR％)改變來(lái)定性或定量檢測(cè)溶液中的E.coliO157:H7。
　　 5、用此生物傳感器對(duì)臨床糞便標(biāo)本進(jìn)行初步應(yīng)用試驗(yàn)：對(duì)臨床糞便模擬陽(yáng)性標(biāo)本和實(shí)際標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)聚丁二炔納米囊泡與標(biāo)本反應(yīng)的CR％值變化評(píng)價(jià)該適配體生物傳感器

5、的性能。
　　 結(jié)果：
　　 1、聚丁二炔納米囊泡的制各與表征：經(jīng)透射電鏡表征證實(shí)，純PDA體系、PDA/DMPC混合磷脂體系以及PDA/DMPC/LPS混合磷脂體系均能形成囊泡，直徑30～100nm左右；經(jīng)254nm紫外線照射，各種體系均從無(wú)色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色；經(jīng)鱟試驗(yàn)證實(shí)，PDA/DMPC/LPS混合磷脂囊泡的內(nèi)毒素活性很低，說(shuō)明絕大部分LPS成功插入囊泡且LPS的特異多糖部分分布在囊泡表面。
　　 2、E.col

6、iO157:H7脂多糖特異性適配體的截短設(shè)計(jì)與驗(yàn)證試驗(yàn)：采用軟件RNAstructure4.5對(duì)截短前后序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，ELISA方法證實(shí)截短后適配體與脂多糖的親和力高于原適配體；激光掃描共聚焦顯微鏡鑒定截短后的適配體與E.coliO157:H7的結(jié)合具有強(qiáng)的綠色熒光，說(shuō)明適配體截短設(shè)計(jì)成功，截短后序列保留的隨機(jī)區(qū)高級(jí)結(jié)構(gòu)是適配體與靶分子結(jié)合的主要部位。
　　 3、適配體-聚丁二炔納米生物傳感器的組裝、穩(wěn)定性評(píng)價(jià)與結(jié)合實(shí)

7、驗(yàn)：經(jīng)紫外-可見(jiàn)光吸收光譜分析證實(shí)，成功將適配體修飾到聚丁二炔納米囊泡表面，其修飾效率大于85％;生物傳感器可保存于4℃、25℃－年以上，透射電鏡觀察囊泡粒徑在50nm左右。說(shuō)明聚丁二炔納米囊泡有較高穩(wěn)定性。經(jīng)透射電鏡以及CR％值證實(shí)適配體-聚丁二炔囊泡與脂多糖具有很高的結(jié)合力。
　　 4、大腸埃希菌O157:H7的快速檢測(cè)：聚丁二炔納米生物傳感器與E.coliO157:H7特異性結(jié)合，通過(guò)納米囊泡顏色從藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色以及CR％

8、的改變來(lái)定性或定量標(biāo)本中的E.coliO157:H7;整個(gè)檢測(cè)在2h內(nèi)完成：線性范圍為104～108CFU/ml，靈敏度達(dá)105CFU/ml，特異性強(qiáng)。
　　 5、對(duì)臨床糞便標(biāo)本檢測(cè)：成功構(gòu)建一種可以快速檢測(cè)糞便標(biāo)本中的EcoliO157:H7的適配體聚丁二炔納米生物傳感器，對(duì)100例臨床糞便模擬陽(yáng)性標(biāo)本檢出率達(dá)96％；203例臨床糞便標(biāo)本(201例陰性標(biāo)本，2例陽(yáng)性標(biāo)本)進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度為100％，特異性為99％，用培養(yǎng)法作參