HCV NS5A下調(diào)抑癌基因GADD45α和PTEN的分子機(jī)制及其生物學(xué)影響.pdf

1、H背景和目的:丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)非結(jié)構(gòu)蛋5A(non-structural5A，NS5A)作為HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白之一，具有重要的生物學(xué)功能。NS5A蛋白參與HCV病毒復(fù)制、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抵抗細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生命活動，與原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生關(guān)系密切。HCV NS5A可能通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)而致病。生長阻滯和DNA損傷45α基因

2、(Growth arrest and DNA damage45-alpha,GADD45α)作為一個腫瘤抑制基因，參與細(xì)胞周期調(diào)控阻滯和生長抑制，維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定，在維持正常的細(xì)胞周期中發(fā)揮重要功能。第十號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因(phosphatase and tensinhomolog deleted in chromosome10，PTEN)作為另一種重要的腫瘤抑制基因，通過對細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)性調(diào)控，抑制腫瘤

3、細(xì)胞的增殖、遷移、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞生長動態(tài)平衡。既往臨床研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者肝癌細(xì)胞GADD45α和PTEN表達(dá)較正常肝細(xì)胞均明顯降低，提示GADD45α和PTEN與原發(fā)性肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。HCV作為原發(fā)性肝癌的主要致病因素之一，其誘導(dǎo)肝癌發(fā)生的機(jī)制仍不十分清楚。在本課題中，我們研究HCVNS5A對GADD45α和PTEN表達(dá)的影響及調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而探討GADD45α和PTEN表達(dá)異常對HCV感染的肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

4、，旨在為HCV感染誘發(fā)肝癌提供新的實(shí)驗依據(jù)。
　　方法:分別使用熒光素酶試驗，相對定量RT-PCR和免疫蛋白印跡檢測HCV NS5A對GADD45α和PTEN啟動子活性、mRNA轉(zhuǎn)錄、和蛋白表達(dá)影響。通過p53過表達(dá)或針對p53、NF-κB、和PI3K的小分子RNA干擾技術(shù)(small interfering RNAs，siRNAs)，研究HCV NS5A對GADD45α表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。此外，通過細(xì)胞活性試驗和克隆形成實(shí)驗評估GA

5、DD45α沉默或GADD45α過表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖活性的影響。同樣，使用小分子化學(xué)抑制劑和小分子RNA干擾技術(shù)探索HCV NS5A對PTEN表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。最后，通過Caspase3/7活性試驗和凋亡蛋白評估肝癌細(xì)胞在PTEN過表達(dá)和Akt活化抑制下的細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:HCVNS5A在轉(zhuǎn)錄水平，通過下調(diào)GADD45α啟動子活性，mRNA轉(zhuǎn)錄，繼而下調(diào)GADD45α蛋白表達(dá)。P53沉默能使GADD45α表達(dá)下調(diào)，而p53過表達(dá)能

6、廢除HCV NS5A對GADD45α的下調(diào)作用。HCV NS5A下調(diào)P53表達(dá)，繼而導(dǎo)致下游GADD45α表達(dá)降低。進(jìn)一步實(shí)驗數(shù)據(jù)表明HCVNS5A促進(jìn)NF-κB和Akt磷酸化。使用針對NF-κB和PI3K-Akt的小分子抑制劑或特異性siRNAs，能抵消HCVNS5A對p53和GADD45α的下調(diào)作用。另外，HCV NS5A蛋白通過抑制P53進(jìn)而下調(diào)GADD45α蛋白表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、生長。而GADD45α過表達(dá)抑制HCVNS5

7、A誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。同樣發(fā)現(xiàn)，HCV在轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)PTEN啟動子活性，mRNA轉(zhuǎn)錄，和PTEN蛋白表達(dá)。NS5A蛋白在HCV成熟蛋白中對PTEN下調(diào)作用最顯著。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HCV NS5A通過ROS途徑促進(jìn)NF-κB磷酸化及非ROS途徑激活PI3K-Akt磷酸化抑制PTEN蛋白表達(dá)。使用小分子抑制劑和siRNAs抑制NF-κB和PI3K-Akt通路，能廢除HCVNS5A對PTEN的下調(diào)。此外，PTEN過表達(dá)能拮抗PI3K對Akt的活化