舒洛地特對(duì)糖尿病大鼠足細(xì)胞podocalyxin、WT1及desmin表達(dá)的影響.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)病率在近幾年呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)。作為ESRD的主要病因之一，DN的預(yù)防和治療越來(lái)越受到研究者的重視。在腎小球的三種固有細(xì)胞中，足細(xì)胞是濾過(guò)屏障的重要成分之一，具有特殊的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)和生理功能。足細(xì)胞損傷導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生，而DN以蛋白尿?yàn)橹饕R床特征，說(shuō)明足細(xì)胞的損傷推動(dòng)DN的發(fā)展。
　　Podocalyxin(PCX)是與CD34及endoglycan密切相關(guān)的唾液

2、蛋白，表達(dá)于腎臟足細(xì)胞、造血祖細(xì)胞、血管內(nèi)皮及神經(jīng)元亞群。PCX在腎臟位于足細(xì)胞的頂膜區(qū)，所攜帶的負(fù)電荷使相鄰的足突分開形成裂孔隔膜(slitdiaphragms，SD)，其抗細(xì)胞相互黏附的特性保持了濾過(guò)膜的開放。DNl的高糖環(huán)境可直接抑制PCX的表達(dá)，從而使帶負(fù)電荷的白蛋白更易濾過(guò)，另外，PCX表達(dá)減少使細(xì)胞與細(xì)胞之間抗粘附作用降低，進(jìn)而加快蛋白尿的發(fā)展進(jìn)程。
　　WT1是一種鋅指樣轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，對(duì)大量的基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。研

3、究發(fā)現(xiàn)PCX是WT1的直接下游區(qū)靶目標(biāo)，WT1可以結(jié)合于PCX基因啟動(dòng)子保守序列，從而具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活力。而WT1本身也是足細(xì)胞的特異標(biāo)志之一，對(duì)維持足細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)及功能有重要作用。
　　Desmin是慢性腎小球病時(shí)足細(xì)胞損傷的早期標(biāo)志物之一。正常情況下，desmin主要位于系膜細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，足細(xì)胞中很少，當(dāng)足細(xì)胞損傷時(shí)可見表達(dá)增強(qiáng)。
　　本課題擬通過(guò)鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)建立糖尿

4、病Sprague Dawley(SD)大鼠模型，應(yīng)用舒洛地特及貝那普利干預(yù)糖尿病大鼠，通過(guò)免疫組織化學(xué)、反轉(zhuǎn)錄PCR、電鏡等方法觀察舒洛地特對(duì)其足細(xì)胞中podocalyxin、WT1及desmin表達(dá)水平的變化，探討舒洛地特是否可以改善糖尿病大鼠足細(xì)胞的異常結(jié)構(gòu)及電荷屏障功能障礙，從而降低蛋白尿、延緩腎衰的發(fā)生，為人類糖尿病腎病的早期預(yù)防及尋找新的治療策略提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。
　　方法：清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，體重約180～200

5、g，共60只，隨機(jī)抽出12只作為正常對(duì)照組(N組)，剩余大鼠腹腔注射STZ(溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液，濃度2％，pH值4.5，注射劑量65mg/kg)方法制備糖尿病大鼠模型，48小時(shí)后測(cè)定血糖、尿糖，血糖≥16.7mmol/L且尿糖持續(xù)陽(yáng)性確定為糖尿病大鼠模型。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組(D組)，貝那普利組(B組)，舒洛地特組(S組)，貝那普利聯(lián)合舒洛地特組(B+S組)，每組12只。N組只注射相同體積的檸檬酸緩沖液。B

6、組給予貝那普利10 mg·kg-1·d-1灌胃，S組給予舒洛地特10 mg·kg-1·d-1灌胃，B+S組給予貝那普利10 mg·kg-1·d-1及舒洛地特10 mg·kg-1·d-1灌胃，N組與D組給予等量的生理鹽水灌胃。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲食，不使用胰島素及其它降糖藥物。分別于造模成功后6、12周收集血、尿及腎組織標(biāo)本，測(cè)定24小時(shí)尿蛋白定量、血肌酐及尿素；石蠟切片行免疫組化染色檢測(cè)腎組織中podocalyxin、desmin表達(dá)

7、情況；行RT-PCR檢測(cè)上述因子mRNA表達(dá)水平；行透射電鏡觀察糖尿病大鼠足細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，組間差異性比較采用單因素方差分析，顯著性水平等于0.05，應(yīng)用SPSS13.0軟件包對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　結(jié)果：
　　1.一般情況D組、B組、S組及B+S組大鼠注射STZ后4～5天即出現(xiàn)多飲、多食、多尿，逐漸消瘦，其中D組癥狀及體重減輕最明顯，而N組則無(wú)上述情況出現(xiàn)。
　　2.各組大鼠24

8、小時(shí)尿蛋白定量、血肌酐及尿素的比較12周末D組小鼠尿蛋白定量、血肌酐和尿素升高最明顯(P<0.01)，B組、S組、B+S組升高次之(P<0.05)，但S組、B組未見明顯差異(P>0.05)。
　　3.免疫組織化學(xué)結(jié)果6周和12周末D組、B組、S組及B+S組大鼠腎組織中podocalyxin、desmin表達(dá)與N組相比，podocalyxin表達(dá)減弱，desmin表達(dá)增強(qiáng)，其中12周末差別更為顯著(P<0.01)；D組與B組、S組、

9、B+S組相比，腎組織中podocalyxin水平進(jìn)一步降低，desmin水平進(jìn)一步升高，12周末變化趨勢(shì)更顯著(P<0.01)；B+S組大鼠腎組織中podocalyxin較同期B組和S組增強(qiáng)(P<0.05)，desmin表達(dá)弱于同期B組和S組(P<0.05)；B組與S組相比，大鼠腎組織中podocalyxin、desmin表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　4.Reverse Transcription-PCR(RT-PCR)結(jié)

10、果與同期正常大鼠相比，糖尿病大鼠腎組織中podocalyxin、WT1的mRNA表達(dá)降低，desmin的mRNA表達(dá)升高，12周末變化更顯著(P<0.01)；S+B組分別與B組和S組比較，podocalyxin、WT1的mRNA表達(dá)升高，desmin的mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；B組與S組相比，大鼠腎組織中podocalyxin、WT1及desmin表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。
　　5.透射電鏡結(jié)果與同期正常大鼠相比，D

11、組、B組、S組及B+S組均可見腎小球基底膜節(jié)段性增厚，伴內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，伴足突融合，但后三組足突融合較前明顯緩解。
　　結(jié)論：
　　1.糖尿病腎病時(shí)podocalyxin、WT1表達(dá)下降，與蛋白尿呈負(fù)相關(guān)，desmin表達(dá)上升，與蛋白尿呈正相關(guān)，提示podocalyxin、WT1及desmin在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定作用。
　　2.舒洛地特能夠明顯減輕了糖尿病大鼠蛋白尿、延緩腎衰發(fā)生，其機(jī)制與上調(diào)podocaly