非洲馬瘟病毒VP7蛋白的原核表達(dá)及其間接ELISA方法的建立.pdf

1、本研究用原核系統(tǒng)成功表達(dá)了非洲馬瘟病毒（African horse sickness virus，AHSV）群特異性蛋白AHSV-VP7，并建立了一種可快速檢測(cè)非洲馬瘟病毒9個(gè)血清型的間接ELISA方法，該方法特異、靈敏，與國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)ELISA試劑盒符合率達(dá)到100％。
　　 本試驗(yàn)針對(duì)非洲馬瘟病毒的群特異性蛋白VP7，通過在GenBank對(duì)VP7蛋白基因進(jìn)行比對(duì)，選取最保守基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以增加其表達(dá)量，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物

2、對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增的目的基因連接到pMD18-T載體中，利用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，與原核表達(dá)載體pET-30a(+)共同構(gòu)建pET-30a-VP7重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入宿主菌大腸桿菌Rosetta(DE3)中高效表達(dá)，得到分子量為44ku的目的蛋白。對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot分析，結(jié)果顯示目的蛋白獲得高效表達(dá)且有特異的免疫學(xué)活性。通過對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，使目的蛋白表達(dá)量增多。然后利用His·B

3、ind kits對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，得到具有抗原活性的純化蛋白，以此作為檢測(cè)抗原，建立了檢測(cè)非洲馬瘟病毒抗體的間接ELISA方法。通過對(duì)該間接ELISA方法的抗原包被量、血清稀釋倍數(shù)、封閉液的選擇等反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定抗原最佳包被濃度為0.625 ng/μL，一抗最佳工作濃度為1∶50，作用時(shí)間為30min，二抗最佳工作濃度為1∶40000，作用時(shí)間為45min，臨界值為0.36,用建立方法檢測(cè)133份血清樣品，并與國(guó)外試劑盒進(jìn)行結(jié)