鴨疫里默氏桿菌生物素合成相關(guān)基因bioF生物學特性分析及應(yīng)用.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌(Riemrella anatipestifer，RA)是一種主要感染鴨類、鵝類，造成感染動物發(fā)病，以心包炎、肝周炎為主要特征的一種接觸性病原菌。感染鴨發(fā)病、死亡率可分別高達90％和75％，已經(jīng)嚴重影響了養(yǎng)鴨業(yè)。生物素(Vitamin H或Co-R)，作為生物體內(nèi)關(guān)鍵酶的發(fā)揮活性所必須的輔因子，有著不可或缺的作用。主要包括:丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC)和?；o酶A羧化酶（Acyl-CoA

2、carboxylase，ACC）等，主要通過羧化、脫羧和轉(zhuǎn)羧基的作用，參與到脂肪酸合成、糖異生以及氨基酸代謝等途徑。生物體攝取生物素有兩種途徑，一種是通過自身合成，另一種是從外界環(huán)境中攝取。大多數(shù)微生物、植物以及真菌都通過第一種方式獲得，而哺乳動物及人類則由于缺少合成生物素相關(guān)酶系，必須通過第二種途徑獲得。因此生物素的合成途徑有可能成為研發(fā)新型抗菌素富有潛力的藥物靶標。本研究從隨機轉(zhuǎn)座子突變庫中篩選到一株生物素合成相關(guān)基因突變株，分析了

3、該突變株的相關(guān)生物學特性，并對突變株的免疫效果作了評估。本研究包括以下2部分內(nèi)容:
　　一、前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)bioF同源基因AS87_RS09170與RA毒力相關(guān)。在本研究中，通過序列分析表明，AS87_S09170基因在RA中高度保守，該基因的編碼產(chǎn)物8-氨基-7-氧代壬酸合成酶(AONS)具有保守的吡哆醛5'-磷酸結(jié)合中心。Western blot分析表明突變株Yb2△bioF的兩種生物素依賴性酶的同工型比野生株Yb2的表

4、達量顯著降低，表明突變株Yb2△bioF生物素生物合成減少。生長曲線的測定表明，Yb2△bioF是一種生物素缺陷型菌株，其在對數(shù)生長期生長速率顯著降低，在補充生物素的條件下，可以回復到野生株的水平。電鏡觀察顯示突變株Yb2△bioF細胞外形不規(guī)則，含有多個牙生的贅生物，外膜凹凸不平，局部不規(guī)則增厚。與野生株相比，Yb2△bioF對鴨胚成纖維細胞的黏附入侵能力和生物被膜形成能力顯著增強。此外，突變株Yb2△bioF感染雛鴨的血液載菌量顯著

5、低于相同劑量野生株感染雛鴨的載菌量，表明AS87_RS09170在RA感染雛鴨模型中建立全身感染至關(guān)重要。本研究首次證實RA生物素的生物合成與細菌生物學特性和致病性相關(guān)。
　　二、本研究對突變株Yb2△bioF作為弱毒苗的免疫效果進行了評價。將突變株Yb2△bioF在TSB和TSA中連續(xù)交替?zhèn)鞔?0次，每隔10代對其菌株形態(tài)、生化反應(yīng)特性、分子生物學特性以及對易感日齡櫻桃谷鴨的致病性進行測定，結(jié)果顯示Yb2△bioF在體外連續(xù)傳代

6、30次后各種特性均不發(fā)生變化，其毒力未見返強。取第30代菌液(Yb2△bioF-F30)感染18日齡櫻桃谷鴨，感染后7天雛鴨精神狀態(tài)、采食飲水、生活習性等均正常，剖檢感染鴨未見心、肝、脾有任何眼觀病變和組織學病變。運用突變株Yb2△bioF制備弱毒活疫苗免疫櫻桃谷鴨，不僅能刺激機體產(chǎn)生較高水平的抗血清2型RA的特異性抗體，同時能刺激機體產(chǎn)生較高水平的Th1類與Th2類細胞因子，表明疫苗免疫后顯著地引起了細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。攻毒保