調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在兒童原發(fā)性腎病綜合征Th17-Treg免疫失衡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文對調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在兒童原發(fā)性腎病綜合征Th17/Treg免疫失衡中的作用及機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（B10）功能紊亂可通過影響Th17/Treg免疫平衡，參與兒童原發(fā)性腎病綜合征（PNS）發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。
　　目的：探討調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（B10）及其不同亞群在兒童原發(fā)腎病綜合征（PNS）外周血中的水平及功能，及其對Th17/Treg免疫平衡的影響。
　　方法：收集2013年9月到

2、2015年12月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院腎內(nèi)科住院及門診隨訪的PNS患兒共60例，其中急性期單純性腎病綜合征（SNS）25例，腎炎型腎病綜合征（NNS）15例，恢復(fù)期單純性腎病綜合征（RM-SNS）12例，恢復(fù)期腎炎型腎病綜合征（RM-SNS）8例；正常體檢兒童外周血20例（Control）。分離的外周血單個核細(xì)胞（PBMC），一管中加入LPS（終濃度10μg/ml）培養(yǎng)7h，過程中加入PMA（終濃度50ng/ml），離子霉素（終濃度5

3、00ng/ml）2h后，BFA（1×）混勻，置于37℃、5％CO2孵箱中，用于Th17、B10以及 B10兩個亞類（CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞和CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞）IL-10分泌水平的檢測；一管中只加入LPS（終濃度10μg/ml），置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)7h，用于Treg細(xì)胞的檢測。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測PBMC中 B10細(xì)胞（CD19+IL-10+B細(xì)胞）、CD19+CD24 hi CD38

4、hi B細(xì)胞、CD19+CD24hi CD27+B細(xì)胞， Th17細(xì)胞和 Treg細(xì)胞的百分比，以及 CD19+B細(xì)胞、CD19+CD24 hi CD38hiB細(xì)胞和CD19+CD24hi CD27+B細(xì)胞IL-10的表達(dá)水平，進(jìn)一步分析B10及其亞群與Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞水平的相關(guān)性。
　　結(jié)果：SNS、NNS組血漿 IgG水平顯著降低（P＜0.001），而恢復(fù)期SNS、NNS組血漿IgG可恢復(fù)至正常。與正常組相比，Th1

5、7細(xì)胞的比例在SNS、NNS組中逐漸升高（P＜0.05）；而Treg細(xì)胞的比例則逐漸降低（P＜0.05）；與正常組相比，SNS、NNS組 Th17/Treg的比值顯著增高（P＜0.05），而與SNS比較，NNS組Th17/Treg比值進(jìn)一步增高（P＜0.05）。與正常組比較，急性期 SNS組、NNS組外周血 B10細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiI

6、L-10+B細(xì)胞及 CD19+CD24hiCD27+ IL-10+B細(xì)胞水平均明顯降低（P＜0.05）；相比急性期SNS組，急性期NNS組外周血B10細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+ B細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiIL-10+B細(xì)胞及CD19+CD24hi CD27+IL-10+B細(xì)胞水平均進(jìn)一步降低（P＜0.05）；而分別與急性期 SNS組、NNS比較，恢復(fù)期 SNS組、NN

7、S組 B10細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞及CD19+CD24hiCD38hiIL-10+B細(xì)胞水平均明顯增高（ P＜0.05）；但恢復(fù)期 SNS組、NNS組外周血CD19+CD24hiCD27+IL-10+B細(xì)胞水平分別與急性期SNS組、NNS組比較，有增高趨勢，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與正常組比較，恢復(fù)期 SNS組、NNS組 B10細(xì)胞、CD19+CD24hiCD3

8、8hiB細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞、 CD19+CD24hiCD38hiIL-10+B細(xì)胞及CD19+CD24hiCD27+IL-10+B細(xì)胞水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)兒童PNS（包括SNS組、NNS組）外周血B10細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞、 CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiIL-10+B細(xì)胞水平及CD19+CD24hi CD27+IL

9、-10+B細(xì)胞與Th17細(xì)胞水平、Th17/Treg比值呈明顯負(fù)相關(guān)（P＜0.05），而與Treg水平呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。兒童PNS24小時尿蛋白定量與Th17細(xì)胞水平、Th17/Treg比值呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），而與B10細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiB細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+ B細(xì)胞水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。
　　結(jié)論：B10細(xì)胞及CD19+CD24hiCD38hiIL-10

10、+B細(xì)胞、CD19+CD24hi CD27+IL-10+B細(xì)胞都可能參與了兒童PNS的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸；恢復(fù)期 SNS、NNS組 CD19+CD24hiCD27hiIL-10+B細(xì)胞水平相比正常組相對降低，這可能是恢復(fù)期PNS患兒易復(fù)發(fā)的潛在免疫學(xué)機(jī)制。B10細(xì)胞及其亞類CD19+CD24hi CD38hiB細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞在兒童 PNS中可發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，可能與通過 IL-10途徑參與對Th17/Treg

11、免疫平衡的影響有關(guān)。
　　第二部分：CD40/CD40L信號通路對兒童PNS外周血調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（B10）分化及功能的影響。
　　目的：結(jié)合第一本部分實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B10及其亞群介導(dǎo)兒童PNS發(fā)生、疾病嚴(yán)重程度及轉(zhuǎn)歸可能通過IL-10途徑，進(jìn)而調(diào)控Th17、Treg細(xì)胞分化及影響Th17/Treg細(xì)胞免疫平衡相關(guān)。但是目前對于影響兒童PNS外周血 B10及其亞群功能紊亂的免疫學(xué)機(jī)制尚不清楚，故本部分旨在探討調(diào)控影響兒童PNS外周血B

12、10分化及功能的免疫學(xué)機(jī)制。
　　方法：利用流式細(xì)胞術(shù)檢測正常兒童及PNS患兒外周血PBMC經(jīng)LPS（終濃度10μg/ml）刺激7h，過程中加入PMA（終濃度50ng/ml），離子霉素（終濃度500ng/ml），BFA（1×）混勻，CD19+ B細(xì)胞的比例以及其分泌 IL-10的水平（即 B10細(xì)胞）；分離的 PBMC經(jīng) CpG（ODN2006，終濃度10μg/ml）+ CD40L（終濃度1μg/ml）刺激48h后，或CpG（OD

13、N2006，終濃度10μg/ml）+anti-CD40L mAb（終濃度1μg/ml）刺激48h后，檢測B10pro+B10細(xì)胞（即為刺激48h后的CD19+IL-10+B細(xì)胞）、CD19+CD24hiCD38 hiB細(xì)胞、CD19+CD24 hi CD27+B細(xì)胞、Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的百分比，以及CD19+ CD24 hi CD38 hi B細(xì)胞、CD19+CD24 hi CD27+B細(xì)胞分泌IL-10的水平。
　　結(jié)果

14、：兒童PNS外周血PBMC，予CpG+CD40L刺激48小時后，急性期SNS及NNS組、恢復(fù)期SNS及NNS組與正常組比較，外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞水平無明顯差異（P＞0.05），Th17/Treg比值可恢復(fù)至正常。急性期 SNS、NNS組及恢復(fù)期 SNS及 NNS組，通過CpG+CD40L刺激48小時， B10pro+B10細(xì)胞、CD19+CD24hi CD38hiIL-10+B細(xì)胞均可恢復(fù)至正常水平?；謴?fù)期 SNS、NNS外

15、周血PBMC中CD19+CD24hiCD27+IL-10+B細(xì)胞與正常組比較仍相對低下，但經(jīng)CpG+CD40L刺激48小時后，CD19+CD24hiCD27+IL-10+B細(xì)胞均可恢復(fù)至正常水平。相比加入 LPS刺激7h，CpG+CD40L刺激48h時， Th17、Th17/Treg比值明顯下調(diào)，而Treg明顯上調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)B10細(xì)胞、CD19+CD24hiCD38hiIL-10+B細(xì)胞、CD19+CD24hi CD27+IL-10+B

16、細(xì)胞水平均明顯上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在兒童PNS外周血PBMC，CpG+anti-CD40L mAb刺激48 h后，外周血 B10pro+B10、CD19+CD24hiCD38hiIL-10+B、CD19+CD24hiCD27+IL-10+B細(xì)胞比例進(jìn)一步降低；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞比例上調(diào)，而Treg細(xì)胞比例下調(diào)，Th17/Treg免疫失衡進(jìn)一步加重。結(jié)合臨床結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)兒童 PNS，血漿IgG水平與Th17/Treg比值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（

17、P＜0.05），而與B10及CD19+CD24hiCD38hi B細(xì)胞、CD19+CD24hiCD27+B細(xì)胞呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）；而血漿IgA、IgM、IgE水平與Th17/Treg比值、B10及其亞群無明顯相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）。
　　結(jié)論：TLR9、CD40通路參與了兒童PNS外周血B10細(xì)胞及其亞群分化及功能成熟，但CD40/CD40L信號通路可能是影響兒童PNS外周血B10及CD19+CD24hiCD38hi