內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒NM株全基因序列的克隆、序列分析.pdf

1、為了擴增內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒NM株全基因序列，參照GenBank中已發(fā)表的內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒的基因組全序列，設計合成七對引物，從經(jīng)臨床病理學檢查健康無病綿羊的子宮組織中提取總DNA，分別使用內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒特異性探針和外源性綿羊肺腺瘤病毒特異性探針，進行斑點雜交鑒定。然后用鑒定后的子宮總DNA為模板，對enJSRV-NM株基因組分7段進行PCR擴增，產(chǎn)物分別為7個(618bp，2006bp，1106bp，1613bp，1145bp

2、，1861bp，613bp)特異性基因片段，將其分別克隆入pMDl9-T載體中進行雙向測序并用DNAstlar軟件進行序列拼接與序列分析，獲得完整的enJSRV—NM株基因組全序列。 結果表明，enJSRV-NM株基因組全長7942bp，有相互重疊的4個較長的開放閱讀框(ORF)，分別代表gag、pro、pol和env基因，此外在pol基因的3’末端重疊一個額外的開放閱讀框(off-x)。與內(nèi)源性南非代表毒株enJS56A1的基

3、因序列比較，核苷酸同源性為99.2％；與外源性美國代表株JSRV<,21>的基因序列比較，核苷酸同源性為92.3％。分析enJsRV-NM株基因組結構，在gag因上沒有發(fā)現(xiàn)外源性iexJSRV特有的Nsca I酶切位點，且在gag基因編碼的NC區(qū)發(fā)現(xiàn)有2個較典型的“胱氨酸一組氨酸序列”，可形成鋅指結構。在env基因編碼的TM區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)外源性exJSRV特異性的“YXXM”基序。enJSRV-NM株推導出的氨基酸與國外報道的exJSRV推

4、導的氨基酸進行同源性比較，在大多數(shù)區(qū)域高達90％～98％，而有3個可變區(qū)(VR1、VR2和VR3)，分別位于gag因和env因，gag因內(nèi)有2個可變區(qū)(VR1、VR2)，另一可變區(qū)VR3位于鯽堪因編碼的TM區(qū)。 應用生物信息學分析技術并對enJSRV-NM株gag因、env堪因所編碼的蛋白分別進行蛋白結構預測，結果顯示gag因、env基因所編碼的蛋白均為結構松散的蛋白分子。這也是我國首次報道的內(nèi)源性綿羊肺腺瘤病毒基因的全序列，為