基于外切酶和納米材料信號放大技術(shù)的核酸修飾酶活性檢測新方法研究.pdf

1、生物傳感技術(shù)由于具有分析時間短、成本較低、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點，極大的推動了分析化學(xué)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。熒光生物傳感技術(shù)因其無需分離、操作簡單、可進(jìn)行原位測定、分析成本低等優(yōu)點而備受關(guān)，目前，已廣泛用于核酸、蛋白質(zhì)、生物活性小分子、病毒等的分析檢測。納米材料具有獨特的光學(xué)和電化學(xué)性質(zhì)，為構(gòu)建生物傳感方法提供了新的思路。近年來，核酸介導(dǎo)的信號放大方法為高靈敏生物檢測提供了重要的技術(shù)支持，在各類生物分子的檢測中得到了廣泛應(yīng)用?；虻男?/p>

2、飾過程與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，而基因修飾受到各種核酸修飾酶的協(xié)同調(diào)控。因此，建立核酸修飾酶活性檢測的新方法新技術(shù)，在癌癥等重大疾病的早期診斷與治療，以及癌癥發(fā)病機理研究中具有重要意義。
　　本論文將納米材料和核酸信號放大技術(shù)應(yīng)用于熒光生物傳感構(gòu)建，發(fā)展了三種熒光生物檢測體系，分別用于Dam甲基轉(zhuǎn)移酶、堿基切除修復(fù)酶等酶活性測定。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.發(fā)展了一種基于氧化石墨烯和T7核酸外切酶輔助循環(huán)信號放大的熒光方

3、法用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)的活性檢測和抑制劑篩選。研究中使用Dam甲基轉(zhuǎn)移酶作為模型分析物。在Dam甲基轉(zhuǎn)移酶存在時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA底物探針被甲基化，然后被DpnⅠ核酸限制性內(nèi)切酶識別并進(jìn)行切割，釋放出單鏈DNA片段。隨后釋放的單鏈DNA與FAM熒光團標(biāo)記的信號探針(DP探針)雜交。在形成的雜交體中，DP探針的5'端為鈍末端，而被釋放的單鏈DNA5'端多出4個堿基。此時，T7核酸外切酶能夠?qū)﹄s交體中DP探針進(jìn)行降解并釋放出單鏈

4、DNA。釋放的單鏈DNA引發(fā)下一輪的雜交-降解循環(huán)。最終大量的FAM熒光團從DP探針5'端釋放。由于較低的親和力，釋放的FAM不能被吸附到氧化石墨烯表面，熒光信號被保留。相反，在沒有Dam甲基轉(zhuǎn)移酶存在時，DP探針可被氧化石墨烯吸附，導(dǎo)致熒光猝滅。將T7核酸外切酶高效的降解能力與氧化石墨烯超強的熒光猝滅效率相結(jié)合，從而獲得較大的信號背景比，提高了Dam甲基轉(zhuǎn)移酶活性測定的靈敏度。并且該方法不需要設(shè)計特定的酶識別位點，也不需要進(jìn)行熒光團/

5、淬滅團的雙標(biāo)記，使得實驗設(shè)計簡單，成本低廉。此外，該方法也適用于Dam甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的測定。
　　2.構(gòu)建了一種基于二硫化鎢納米片及核酸外切酶Ⅲ共輔助信號增強策略的DNA糖基化酶熒光偏振檢測方法。在本工作中，我們以尿吡啶DNA糖基化酶(UDG)和8-氧代鳥嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)為研究模型。底物探針HP頸部含受損的堿基，在DNA糖基化酶存在情況下會切除受損的堿基，此時HP熔鏈溫度降低，并且打開。打開后的HP會與FAM標(biāo)記

6、的單鏈DNA(DP)雜交，在雜交體中，DP的3'端是凹末端，ExoⅢ會對雜交體中DP進(jìn)行消化，通過DP不斷的雜交與釋放過程，大量的FAM被釋放，釋放的FAM不會吸附到WS2納米片表面，熒光偏振信號值很小。沒有DNA糖基化酶活時，DP與HP不會雜交，因此ExoⅢ不會降解DP。單鏈DP能夠吸附到WS2納米片表面，質(zhì)量變大，偏振增強。結(jié)合WS2納米片和ExoⅢ共同輔助信號放大作用，可實現(xiàn)對DNA糖基化酶的高靈敏測定。此外，該方法也實現(xiàn)了對細(xì)胞

7、粗提取物中UDG活性測定。并實現(xiàn)對UDG活性的抑制試驗。最后，該方法設(shè)計簡單，易于操作，選擇性好，有望用于DNA糖基化酶相關(guān)機制研究和疾病診斷中。
　　3.利用SGⅠ作為熒光信號分子，基于核酸外切酶Ⅰ(ExonucleaseⅠ，ExoⅠ)的信號放大構(gòu)建了一種簡單、經(jīng)濟、高靈敏的熒光方法用于UDG活性檢測。本工作中，以莖部區(qū)域含有四個尿嘧啶堿基的發(fā)夾探針(HP)作為UDG的底物。在沒有UDG存在時，SGⅠ染料可以與HP結(jié)合，熒光大大