香菇中半胱氨酰亞砜裂解酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、20世紀(jì)70年代，日本學(xué)者在研究香菇風(fēng)味物質(zhì)代謝過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)香菇在生長(zhǎng)過(guò)程中能夠產(chǎn)生甲醛，但是當(dāng)時(shí)并沒(méi)有引起足夠的重視。自2002年以來(lái)的出口過(guò)程中，香菇內(nèi)源性甲醛引發(fā)的“香菇甲醛事件”，引起商界與消費(fèi)者的疑慮以及輸入國(guó)政府的高度關(guān)注，導(dǎo)致我國(guó)香菇出口因?yàn)椤熬G色壁壘”和“技術(shù)壁壘”問(wèn)題屢屢受挫，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此研究香菇內(nèi)源性甲醛生成的關(guān)鍵酶，為進(jìn)一步闡釋香菇內(nèi)源性甲醛形成機(jī)理具有非常重要的意義。本研究以參與香菇中甲醛生成的關(guān)鍵

2、酶之一即半胱氨酰亞砜裂解酶(C-S lyase)為研究對(duì)象，首先優(yōu)化了該酶的提取、分離和純化條件，然后研究了該酶的基本酶學(xué)特性，并且初步探索了酶的結(jié)構(gòu)。本研究將為進(jìn)一步闡明香菇內(nèi)源性甲醛的生成機(jī)理提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下所示:
　　 1、C-S lyase分離純化條件的優(yōu)化:采用機(jī)械攪拌提取法提取20min，C-S lyase提取率較高，用時(shí)較短。用含量為25％的聚乙二醇(PEG)6000靜置2h，可以去除一些不穩(wěn)定雜蛋白

3、，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)酶捕獲，得到酶比活力高的沉淀。Hydroxyapatite柱分離目標(biāo)酶的最優(yōu)化條件:填充柱為(φ)2.6 cm×8 cm，流速為1mL/min，洗脫條件為0.02mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.2)、0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH7.2)梯度洗脫。收集比活力含量高的酶后冷凍干燥，于-80℃保存。
　　 2、采用優(yōu)化后的分離純化方案，使C-S lyase的純化倍數(shù)達(dá)到157.1，得率為10.7％。采用SDS-PAG

4、E電泳測(cè)得C-S lyase中含有44.3kDa的亞基。C-S lyase中不含有丙氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸，含量最多的是酪氨酸。疏水性氨基酸比例為5.18％親水性氨基酸比例為91.4％。采用紅外光譜分析得到C-S lyase二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)占32.68％，β-折疊占30.69％，β-轉(zhuǎn)角占24.50％，無(wú)規(guī)則卷曲占12.13％。
　　 3、通過(guò)酶學(xué)性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，C-S lyase與S-甲基-L-半胱氨酸亞砜親和能力最強(qiáng)，

5、Km為2.16+0.068 mmol/L，Vmax為0.026+0.003mmol/min; C-S lyase在pH為7時(shí)活性最高;磷酸吡哆醛濃度濃度越高，酶活反應(yīng)速率最高，當(dāng)磷酸吡哆醛達(dá)到60μmol/L后反應(yīng)速率不再升高;適宜的溫度可以提高反應(yīng)速率，溫度大于40℃時(shí)，反應(yīng)速率不再增加;70℃的高溫使酶活在1.5h下降91.53％; Fe2+、Fe3+和Cu2+對(duì)C-S lyase有較強(qiáng)的抑制作用。
　　 4、不同添加量的維