結核分枝桿菌(Mtb)毒力因子Rv3033促進Mtb在巨噬細胞中存活的機制研究.pdf

1、結核?。═B）是長久以來困擾人們生活和工作的呼吸道傳播疾病。它是由結核分枝桿菌引起的慢性傳染性疾病。1882年科赫發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌以來，迄今為止結核病的死亡人數(shù)已達數(shù)億人。結核分枝桿菌是一種需氧，無運動能力，生長緩慢，富含脂質的抗酸性染色陽性的分枝桿菌。巨噬細胞是結核分枝桿菌的主要寄居細胞，也是機體抵抗結核分枝桿菌的主要場所。多年來，科學家們致力于結核分枝桿菌與巨噬細胞之間的功能研究，預期找到更為優(yōu)越的治療結核分枝桿菌的藥物靶點。細胞凋

2、亡在控制結核分枝桿菌在體內的生存及生長過程中具有重要作用，它不僅參與直接清除結核分枝桿菌的固有免疫，而且將凋亡小體提呈給T細胞，進而通過適應性免疫清除結核分枝桿菌。在這種相互依存又相互制約的環(huán)境下，結核分枝桿菌也產生多種抗衡手段，其中主要通過結核分枝桿菌自身的毒力蛋白發(fā)揮作用。Rv3033是結核分枝桿菌的一個毒力因子，其大小約為19kDa，能夠促進結核分枝桿菌在巨噬細胞中的生存。但其在巨噬細胞中的作用尚未可知。因而深入了解與發(fā)現(xiàn)Rv30

3、33在巨噬細胞中的功能不但幫助我們揭示這一毒力蛋白的作用機理，同時也為我們找到新的藥物靶點提供理論基礎和前提。
　　本研究通過分子生物學技術，構建上調表達質粒pMSCV–eGFP-Rv3033，包裝逆轉錄病毒感染RAW264.7細胞，構建上調表達Rv3033及Vector的巨噬細胞穩(wěn)轉株（RAW-Rv3033及 RAW-Vector）。用 Mtb（BCG/H37Rv）感染RAW-Rv3033與 RAW-Vector，觀察 Rv30

4、33對于結核分枝桿菌在巨噬細胞中存活的影響。CFU檢測發(fā)現(xiàn)，Rv3033能夠促進結核分枝桿菌在巨噬細胞中的存活。BCG感染RAW-Rv3033及RAW-Vector12h后，通過高通量測序共發(fā)現(xiàn)464個差異表達基因，其中上調表達的差異基因有235個，下調表達的差異基因有229個。差異表達基因的功能主要涉及以下幾個過程：凋亡、自噬、細胞周期及炎癥等，以細胞凋亡為主。采用結核分枝桿菌減毒株BCG感染RAW-Rv3033與RAW-Vector

5、，觀察Rv3033對巨噬細胞凋亡的影響并做機制探討。結果顯示，上調Rv3033能夠抑制BCG感染引起的凋亡，并且這種凋亡的抑制現(xiàn)象是通過阻礙ER stress實現(xiàn)的。最后，原核表達純化Rv3033蛋白，與RAW264.7細胞裂解液共孵育后，pull down尋找與Rv3033相互作用的蛋白。質譜分析后，篩選出8個可能與Rv3033相互作用的蛋白:Lrrfip1，Cofilin-1，Rhog，Rac2，HMGA1，Arhgap15，Arp