蜂毒肽與基因變構(gòu)IL-2融合蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的構(gòu)建融合基因蜂毒肽(melittin)與人變構(gòu)白介素2[M-IL-2(88Arg,125Ala)]畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZα A/M-IL-2(88Arg，125Ala)，轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115。篩選多拷貝陽(yáng)性菌株，甲醇誘導(dǎo)多拷貝陽(yáng)性菌株表達(dá)融合蛋白，分離純化該融合蛋白，并進(jìn)行抗菌及抗腫瘤生物學(xué)活性研究。
　　方法以質(zhì)粒pET-15 b/M-IL-2(88Arg，125Ala)為模板，PCR獲得目的基因，構(gòu)建重組載體

2、pPICZα A/M-IL-2(88Arg，125Ala);通過(guò)電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115;MMH，MDH篩選Mut+表型陽(yáng)性菌株GS115; ZeocinTM梯度法及熒光定量PCR法篩選多拷貝轉(zhuǎn)化酵母菌株。陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)甲醇持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)，提取上清，SDS-PAGE及BCA法檢測(cè)最佳誘導(dǎo)時(shí)間，Western blot鑒定抗原性及特異性。經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀法、透析法、鎳離子親和層析純化融合蛋白;液相測(cè)定法研究融合蛋白抑菌活性，CCK-8法檢

3、測(cè)該融合蛋白抗腫瘤活性。
　　結(jié)果成功構(gòu)建畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株GS115/M-IL-2(88Arg，125Ala)。經(jīng)MDH及MMH篩選出Mut+型重組菌株GS115/M-IL-2(88Arg，125Ala)。ZeocinTM梯度法及熒光定量PCR法成功篩選出兩株多拷貝轉(zhuǎn)化酵母菌株。SDS-PAGE檢測(cè)在26kDa左右有明顯目的條帶，與理論值相符。BCA法測(cè)定甲醇誘導(dǎo)120h融合蛋白表達(dá)量達(dá)到最高濃度814.5 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于

4、該融合蛋白存原核系統(tǒng)中產(chǎn)量。Western blot鑒定該融合蛋白具有抗原特異性。經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀法、透析法、鎳離子親和層析法獲得純度為99％的目的蛋白，經(jīng)濃縮管濃縮獲得濃度為432.5mg/L的目的蛋白5 mL。經(jīng)檢測(cè)純化的融合蛋白具有抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)活性，具有較強(qiáng)抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞及Hela的生長(zhǎng)增殖的生物活性。
　　結(jié)論成功構(gòu)建畢赤酵母分泌表達(dá)重組載休pPICZα A/M-IL-2(88Arg，