分子信標(biāo)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)志賀菌ipaH基因的研究.pdf

1、目的：用分子信標(biāo)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)志賀菌ipaH基因。 方法：根據(jù)GenBank上公布的福氏志賀菌M32063株ipaH基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物和一條分子信標(biāo)探針。選取4株志賀菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及大腸桿菌、腸炎沙門(mén)菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌，4種細(xì)菌作陰性對(duì)照，進(jìn)行志賀菌ipaH基因特異性擴(kuò)增；根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果及序列分析結(jié)果，選定福氏志賀菌M32063株ipaH基因序列第1236-1806位核苷酸目標(biāo)序列，進(jìn)行特異性擴(kuò)增，提取純化產(chǎn)物；將

2、純化好的PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上，得到pGEM-T-ipaH重組克隆載體；擴(kuò)增pGEM-T-ipaH重組質(zhì)粒的菌液，送生物技術(shù)公司測(cè)序，與GenBank上公布的福氏志賀菌M32063株ipaH基因進(jìn)行核苷酸序列的比對(duì)；用無(wú)菌水按照10的倍數(shù)方法稀釋pGEM-T-ipaH重組質(zhì)粒，并得到梯度濃度的pGEM-T-ipaH重組質(zhì)粒；取不同濃度pGEM-T-ipaH重組質(zhì)粒作模板進(jìn)行PCR及real-timePCR，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇

3、不同退火溫度、Mg2+濃度、探針濃度，最終得出優(yōu)化后的real-timePCR反應(yīng)條件；隨后進(jìn)行靈敏度分析、構(gòu)建陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品、通過(guò)拷貝數(shù)與Ct值之間的線性關(guān)系，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線；收集20份未知臨床腹瀉患者糞便樣本，進(jìn)行分子信標(biāo)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)志賀菌ipaH基因，為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可靠性，同時(shí)采用熒光終點(diǎn)法對(duì)20份未知臨床腹瀉患者糞便樣本進(jìn)行熒光值測(cè)定。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)得出結(jié)果如下： 1.賀菌ipaH基因采用P1、P2和P3、P4

4、兩對(duì)引物，分別成功擴(kuò)增出571bp和150bp片斷，電泳結(jié)果顯示特異性好、靈敏度高。 2.福氏志賀菌ipaH基因片斷導(dǎo)入載體菌后，經(jīng)過(guò)測(cè)序證實(shí)與NCBI基因序列的同源性為99％。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)用重組質(zhì)粒中含有ipaH基因571bp的片斷，可以作陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建陽(yáng)性模板。 3.選擇不同的退火溫度、Mg2+濃度、探針濃度，優(yōu)化real-timePCR反應(yīng)條件。 4.本實(shí)驗(yàn)以10的倍數(shù)系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品為模板，P3、P4為上下游引

5、物，經(jīng)FTC2000熒光定量擴(kuò)增儀擴(kuò)增，靈敏度達(dá)到1.0×103copy/ml，經(jīng)實(shí)驗(yàn)比較，比電泳法高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。通過(guò)計(jì)算機(jī)將Ct值與不同的濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)數(shù)值作圖，得出一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示Ct值和模板啟始濃度的拷貝數(shù)之間具有較好的線性關(guān)系(r=0.98)。 5.對(duì)20份未知的臨床腹瀉患者糞便樣本用分子信標(biāo)PCR技術(shù)檢測(cè)志賀菌ipaH基因，16份臨床腹瀉患者糞便樣本檢測(cè)有熒光信號(hào)，判斷結(jié)果為陽(yáng)性，而其余4份臨床腹瀉患者糞便樣本無(wú)

6、熒光信號(hào)，判斷結(jié)果為陰性。檢測(cè)時(shí)間約4h。 6.采用熒光終點(diǎn)法檢測(cè)20份臨床腹瀉患者的糞便樣本，結(jié)果與real-timePCR檢測(cè)結(jié)果一致，驗(yàn)證了分子信標(biāo)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)志賀菌ipaH基因的準(zhǔn)確性及可靠性。 結(jié)論：通過(guò)實(shí)驗(yàn)本研究發(fā)現(xiàn)： 1.異性ipaH基因是Shigella存在的直接標(biāo)志，與腹瀉有關(guān)，是產(chǎn)生痢疾有關(guān)病癥的必要致病因子。 2.分子信標(biāo)熒光探針檢測(cè)志賀菌ipaH基因，其突出的優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)

7、過(guò)程中特異性結(jié)合明顯高于其它常規(guī)核酸探針，敏感度高，定量檢測(cè)下限的指標(biāo)好。更有操作簡(jiǎn)單、快速、防污染等特點(diǎn)，是目前檢測(cè)志賀菌的有效方法。 3.采用real-timePCR和熒光終點(diǎn)法檢測(cè)20份臨床腹瀉患者的糞便樣本，結(jié)果一致。驗(yàn)證了分子信標(biāo)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)志賀菌ipaH基因的準(zhǔn)確度及可靠性。 4.分子信標(biāo)熒光定量PCR技術(shù)是一種全新的PCR分子雜交模式，集PCR擴(kuò)增、熒光探針雜交、熒光檢測(cè)一體化。可一次性檢測(cè)96份