產(chǎn)甘油假絲酵母胞漿3-磷酸甘油脫氫酶基因CgGPD啟動子在釀酒酵母中的功能分析.pdf

1、產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5具有耐高滲并且高產(chǎn)甘油的特性，已被廣泛用于甘油的工業(yè)化生產(chǎn)。自實現(xiàn)工業(yè)化以來，為了進一步提高其產(chǎn)量性狀，本中心著重在菌種和其關(guān)鍵酶表達以及發(fā)酵工藝等方面做了大量的工作，至今仍未取得實質(zhì)性突破，最可能的原因是我們對其遺傳背景知之甚少，亟待完善。為了進一步提高產(chǎn)甘油假絲酵母的產(chǎn)量性狀，完善其遺傳背景研究，闡明其高產(chǎn)甘油的機理，由于胞漿3-磷酸甘油脫氫酶是甘油合成途徑中的關(guān)鍵酶，因此本課題組通過簡并PCR技術(shù)首次

2、從產(chǎn)甘油假絲酵母克隆到編碼產(chǎn)甘油假絲酵母胞漿3-磷酸甘油脫氫酶基因CqGPD，與釀酒酵母GPD1基因相比對，發(fā)現(xiàn)二者的同源性只有54.15％，表明產(chǎn)甘油假絲酵母的CgGPD基因是一個新的基因，因此弄清它的分子機理將可能為解釋該菌株高轉(zhuǎn)化率、高產(chǎn)甘油提供一個重要的依據(jù)，同時研究還發(fā)現(xiàn)CgGPD是一種滲透壓調(diào)節(jié)基因，所以懷疑其啟動子PCggpd受滲透壓調(diào)控，故本研究根據(jù)已獲得的CgGPD的相關(guān)序列設(shè)計引物，用PCR技術(shù)克隆出該基因的啟動子P

3、Cggpd，通過比對發(fā)現(xiàn)該啟動子與來自釀酒酵母GPD1的啟動子在序列特征上存在明顯差異，兩者同源性僅有28.75％，說明PCggpd是一個全新的啟動子。 為了更好地對PCggpd的功能進行分析，本研究克隆了來自于水母的綠色熒光蛋白基因gfp，構(gòu)建了含報告基因gfp的重組表達載體pYX212-zeocin-PCggpd-gfp，電擊轉(zhuǎn)入釀酒酵母W303-1A中，然后將重組型釀酒酵母置于含不同濃度的NaCl、KCl、葡萄糖、甘露醇、

4、山梨醇等滲透壓調(diào)節(jié)劑的YEPD培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，檢測PCggpd啟動報告基因gfp表達的差異。通過熒光檢測表明，PCggpd不僅成功啟動了gfp的表達，而且在不同滲透壓條件下，gfp的表達存在明顯差異。這主要是由于啟動子PCggpd對不同滲透壓的響應(yīng)情況引起。在高滲條件下熒光蛋白表達明顯增強，說明高滲條件對PCggpd具有很強誘導(dǎo)作用。從PCggpd受高滲條件誘導(dǎo)以及隨著滲透壓的提高誘導(dǎo)作用隨之增強的特性可以看出PCggpd很可能是產(chǎn)甘

5、油假絲酵母在高滲條件下高轉(zhuǎn)化率、高產(chǎn)甘油的重要因素之一，這將對完善產(chǎn)甘油假絲酵母的遺傳背景，闡明其高產(chǎn)甘油的機理具有重要意義。 為了進一步驗證啟動子的PCggpd的功能，將誘導(dǎo)型啟動子PCggpd在抗性育種和異源蛋白表達等方面得以應(yīng)用，本研究進行了初步探索。首先克隆了不含信號肽的來自于枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶基因amy，構(gòu)建了釀酒酵母游離型重組表達載體pYX212-zeocin-PCggpd-amy，即將α-淀粉酶基因amy置于