miRNA-451表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)iNOS基因表達(dá)的抑制.pdf

1、目的：構(gòu)建miRNA-451真核表達(dá)重組質(zhì)粒及其對(duì)照重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染小鼠腎小球系膜細(xì)胞,研究miRNA-451對(duì)腎小球系膜細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)基因表達(dá)的影響。
　　 方法：依據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中mlnu-miR-451序列,添加酶切位點(diǎn)及polyT轉(zhuǎn)錄終止序列,設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸片段,退火處理后克隆至真核表達(dá)載體pGenesil-1質(zhì)粒中,經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序驗(yàn)證后,構(gòu)建成為miRNA-451真核表達(dá)載體(pGene

2、sil-1-miRNA-451質(zhì)粒)。同時(shí)同法設(shè)計(jì)一對(duì)隨機(jī)對(duì)照單鏈寡核苷酸片斷構(gòu)建成為陰性對(duì)照重組質(zhì)粒(pGenesil-1-control)。將pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control質(zhì)粒用lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染小鼠腎小球系膜細(xì)胞,經(jīng)G418篩選,建立穩(wěn)定表達(dá)pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control的細(xì)胞株。采用MTT比色法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)并繪

3、制生長(zhǎng)曲線(xiàn)；RT-PCR、Westernblot及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后iNOS基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平,運(yùn)用生物學(xué)軟件分析圖像結(jié)果。
　　 結(jié)果：經(jīng)酶切鑒定及測(cè)序證實(shí)pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。與未處理的小鼠腎小球系膜細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)pGenesil-1-control的細(xì)胞相比,在穩(wěn)定表達(dá)pGenesil-1-miRNA-451的小鼠腎小球系膜細(xì)胞中,細(xì)胞增殖受到