幽門螺桿菌重組蛋白SlyD對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響及其機制.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要病因，與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[1]。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)已將幽門螺桿菌列為Ⅰ級致癌因子[2]。全世界有平均50％的人口感染幽門螺桿菌，約有20％～30％的感染人口會漸漸發(fā)展為不同程度的胃炎、消化道潰瘍或胃腺癌。
　　宿主感染細菌的臨床結(jié)局與細菌毒力因素、宿主反應(yīng)和環(huán)境因素有關(guān)。其中細菌本身的特性尤其是毒力因子可能起了關(guān)鍵作用[3

2、]。目前較為關(guān)注的H.pylori與臨床結(jié)局相關(guān)的毒力因子，主要包括cagA，vacA s1，oipA，babA2，dupA以及hrgA等，但這些毒力因子缺乏明確與胃癌相關(guān)的特異的流行病學(xué)標志，無法明確解釋其致胃癌的機制[4，5]，新的與胃癌有關(guān)的毒力因子的研究將有助于進一步解釋這些問題。
　　本室在前期研究中，采用抑制性消減雜交(SSH)以及斑點雜交的方法構(gòu)建了H.pylori胃癌來源株和淺表性胃炎來源株差異基因文庫，對篩選出的

3、差異基因進行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)slyD基因為胃癌來源株的高拷貝基因，可能與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]，其編碼產(chǎn)物SlyD蛋白具有肽基-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PPIase)活性，屬于PPIase-FKBP(FK506 binding protein)家族[7]。PPIase-FKBP在多種細菌中作為毒力因子參與微生物致病過程。嗜肺軍團桿菌中(Legionella p

4、neumophila)的Mip蛋白屬于PPIase-FKBP家族，是該菌的重要毒力因子，協(xié)助細菌在細胞內(nèi)生長繁殖，有效逃避宿主免疫機制攻擊，其編碼基因缺失突變的菌株感染單核細胞以及肺上皮細胞的能力顯著下降[8]。類鼻疽伯克式桿菌(Burkholderia pseudomallei)的PPIase-FKBP可以協(xié)助細菌抵抗宿主免疫機制的殺滅，促進細菌周期性集群運動以及蛋白酶的產(chǎn)生，其編碼基因缺失突變株毒力顯著下降[9]。那么，SlyD是否

5、也作為毒力因子參與H.pylori致病過程，以及H.pylori slyD確切的功能及生物學(xué)效應(yīng)尚未可知。
　　目的：
　　本研究擬利用分子克隆技術(shù)，通過構(gòu)建幽門螺桿菌SlyD原核表達載體，純化SlyD蛋白，在此基礎(chǔ)上，深入研究幽門螺桿菌SlyD的生物學(xué)效應(yīng)及其作用機制，為探討幽門螺桿菌致病機制及開展有針對性的預(yù)防措施提供重要的理論依據(jù)及實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　一、幽門螺桿菌SlyD蛋白的原核表達、純化及鑒定

6、
　　根據(jù)GenBank中已報道的HPSH_05790的全基因組序列，用Primer5.0設(shè)計SlyD引物，并在引物中加入限制性酶切位點，以幽門螺桿菌胃癌來源菌株L301為模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增獲得目的片段。將其進行T-A克隆至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌(Escherichiacoli，E.coli) DH5a，雙酶切鑒定篩選陽性克隆，進行序列測定;將測序結(jié)果提交GenBank，獲得基因登錄號，用序列比對分析

7、SlyD基因的同源性;再將其定向插入pET-28a(+)載體，構(gòu)建pET-28a(+)-S1yD表達載體，轉(zhuǎn)化到表達宿主菌E.coliBL21，通過卡那霉素抗性篩選和雙酶切鑒定陽性克隆;IPTG誘導(dǎo)其表達，并優(yōu)化其表達條件（誘導(dǎo)時間和IPTG濃度），表達的SlyD蛋白用AKTAprimeTM plus層析系統(tǒng)進行自動純化;純化后的重組蛋白經(jīng)PPIase檢測其活性。
　　二、幽門螺桿菌SlyD對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響
　　1

8、、利用CCK-8以及western-blot檢測PCNA、細胞免疫熒光檢測KI-67等方法觀察HpSlyD對胃癌細胞AGS增殖效應(yīng)的影響。
　　2、通過軟瓊脂克隆形成實驗觀察HpSlyD對AGS細胞克隆形成能力的影響。
　　3、利用transwell以及western-blot和細胞免疫熒光檢測MMP-9表達等方法觀察HpSlyD對AGS細胞遷移效應(yīng)的影響。
　　4、利用caspase-3活性檢測以及western-b

9、lot檢測caspase-3表達等方法觀察HpSlyD對AGS細胞凋亡效應(yīng)的影響。
　　三、幽門螺桿菌SlyD影響胃癌細胞增殖的機制
　　1、利用AGS和N87兩種細胞系進一步證實HpSlyD對胃癌細胞的增殖作用。
　　2、利用Westernblot檢測HpSlyD對p38、ERK、JNK以及轉(zhuǎn)錄因子NF-KB和IKB蛋白磷酸化表達水平的影響。
　　3、觀察信號通路特異性抑制劑PD98059和SB203580對胃

10、癌細胞增殖及信號傳導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白的影響。
　　4、利用TLR4抗體中和TLR4作用后，觀察HpSlyD對p38及ERK信號傳導(dǎo)通路的影響。
　　結(jié)果：
　　一、幽門螺桿菌SlyD蛋白的原核表達、純化及鑒定
　　1.H.pyloriSlyD測序結(jié)果表明SlyD基因全長564bp，編碼182個氨基酸，與GenBank中已知其他菌株基因序列的核苷酸同源性為97％。
　　2、成功構(gòu)建了pET28a+-slyD原核

11、表達質(zhì)粒，DNA測序后與GeneBank公布的基因序列一致。
　　3、成功誘導(dǎo)表達并純化了SlyD蛋白，經(jīng)Western blot檢測結(jié)果顯示:該重組蛋白可與抗His標簽抗體結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)AKTAprimeTM plus層析系統(tǒng)進行自動純化后可獲得純度約為97％，相對分子質(zhì)量(Mr)約為34kDa的rSlyD，與預(yù)測結(jié)果一致，蛋白活性檢測其具有PPIase活性。
　　二、幽門螺桿菌SlyD對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響
　　

12、1、不同濃度的幽門螺桿菌重組蛋白SlyD與AGS細胞作用24、48及72h后，細胞增殖的程度隨著rSlyD濃度的增加和作用時間的延長而逐漸增加。
　　Western-blot及細胞免疫熒光結(jié)果亦顯示，rSlyD可以使PCNA及KI-67的表達增強。
　　2、集落形成實驗表明，rSlyD處理三周后的AGS細胞與對照組相比(P＜0.05)形成集落數(shù)最多。
　　3、transwell實驗表明，100ng/ml rSlyD作用

13、于AGS細胞48h后，發(fā)現(xiàn)其具有促進胃癌細胞遷移的能力(與對照組比較P＜0.05)。此外，Western-blot及細胞免疫熒光結(jié)果亦顯示:rSlyD可以使MMP-9的表達增強。
　　4、caspase-3活性檢測及western-blot檢測caspase-3表達顯示:100ng/mlrSlyD作用于AGS細胞48h后，具有抑制胃癌細胞凋亡的能力（與對照組比較 P＜0.05)。
　　三、幽門螺桿菌SlyD影響胃癌細胞增殖的

14、機制
　　1、WesternBlot結(jié)果顯示:HpSlyD可以上調(diào)p-p38及p-ERK蛋白表達的水平而對p-JNK蛋白表達水平無影響。
　　2、HpSlyD促進胃癌細胞增殖主要是通過激活P38及ERKI/2兩條主要通路。抑制P38和MAPK/ERK通路可部分逆轉(zhuǎn)HpSlyD促進胃癌細胞增殖的作用。提示激活P38和MAPK/ERK通路是HpSlyD促進腫瘤細胞增殖的機制之一。
　　3、WesternBlot結(jié)果顯示:H

15、pSlyD可以上調(diào)TLR4、p-NF-κB及p-ⅠκB蛋白表達水平。
　　4、HpSlyD可以引起TLR4表達上調(diào)，進而激活P38/p-ERK-IKB-NF-KB通路。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建了HpSlyD基因的原核表達載體，獲得了HpSlyD重組蛋白。
　　2.HpSlyD具有促進胃癌細胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)化，抑制胃癌細胞凋亡的能力。
　　3.HpSlyD通過上調(diào)TLR4表達進而激活P38/p-ERK-