幽門螺桿菌重組蛋白SlyD對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要病因，與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[1]。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將幽門螺桿菌列為Ⅰ級致癌因子[2]。全世界有平均50％的人口感染幽門螺桿菌，約有20％～30％的感染人口會(huì)漸漸發(fā)展為不同程度的胃炎、消化道潰瘍或胃腺癌。
　　宿主感染細(xì)菌的臨床結(jié)局與細(xì)菌毒力因素、宿主反應(yīng)和環(huán)境因素有關(guān)。其中細(xì)菌本身的特性尤其是毒力因子可能起了關(guān)鍵作用[3

2、]。目前較為關(guān)注的H.pylori與臨床結(jié)局相關(guān)的毒力因子，主要包括cagA，vacA s1，oipA，babA2，dupA以及hrgA等，但這些毒力因子缺乏明確與胃癌相關(guān)的特異的流行病學(xué)標(biāo)志，無法明確解釋其致胃癌的機(jī)制[4，5]，新的與胃癌有關(guān)的毒力因子的研究將有助于進(jìn)一步解釋這些問題。
　　本室在前期研究中，采用抑制性消減雜交(SSH)以及斑點(diǎn)雜交的方法構(gòu)建了H.pylori胃癌來源株和淺表性胃炎來源株差異基因文庫，對篩選出的

3、差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)slyD基因?yàn)槲赴﹣碓粗甑母呖截惢?，可能與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]，其編碼產(chǎn)物SlyD蛋白具有肽基-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase，PPIase)活性，屬于PPIase-FKBP(FK506 binding protein)家族[7]。PPIase-FKBP在多種細(xì)菌中作為毒力因子參與微生物致病過程。嗜肺軍團(tuán)桿菌中(Legionella p

4、neumophila)的Mip蛋白屬于PPIase-FKBP家族，是該菌的重要毒力因子，協(xié)助細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)生長繁殖，有效逃避宿主免疫機(jī)制攻擊，其編碼基因缺失突變的菌株感染單核細(xì)胞以及肺上皮細(xì)胞的能力顯著下降[8]。類鼻疽伯克式桿菌(Burkholderia pseudomallei)的PPIase-FKBP可以協(xié)助細(xì)菌抵抗宿主免疫機(jī)制的殺滅，促進(jìn)細(xì)菌周期性集群運(yùn)動(dòng)以及蛋白酶的產(chǎn)生，其編碼基因缺失突變株毒力顯著下降[9]。那么，SlyD是否

5、也作為毒力因子參與H.pylori致病過程，以及H.pylori slyD確切的功能及生物學(xué)效應(yīng)尚未可知。
　　目的：
　　本研究擬利用分子克隆技術(shù)，通過構(gòu)建幽門螺桿菌SlyD原核表達(dá)載體，純化SlyD蛋白，在此基礎(chǔ)上，深入研究幽門螺桿菌SlyD的生物學(xué)效應(yīng)及其作用機(jī)制，為探討幽門螺桿菌致病機(jī)制及開展有針對性的預(yù)防措施提供重要的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　一、幽門螺桿菌SlyD蛋白的原核表達(dá)、純化及鑒定

6、
　　根據(jù)GenBank中已報(bào)道的HPSH_05790的全基因組序列，用Primer5.0設(shè)計(jì)SlyD引物，并在引物中加入限制性酶切位點(diǎn)，以幽門螺桿菌胃癌來源菌株L301為模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得目的片段。將其進(jìn)行T-A克隆至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌(Escherichiacoli，E.coli) DH5a，雙酶切鑒定篩選陽性克隆，進(jìn)行序列測定;將測序結(jié)果提交GenBank，獲得基因登錄號，用序列比對分析

7、SlyD基因的同源性;再將其定向插入pET-28a(+)載體，構(gòu)建pET-28a(+)-S1yD表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌E.coliBL21，通過卡那霉素抗性篩選和雙酶切鑒定陽性克隆;IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)，并優(yōu)化其表達(dá)條件（誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度），表達(dá)的SlyD蛋白用AKTAprimeTM plus層析系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)純化;純化后的重組蛋白經(jīng)PPIase檢測其活性。
　　二、幽門螺桿菌SlyD對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　1

8、、利用CCK-8以及western-blot檢測PCNA、細(xì)胞免疫熒光檢測KI-67等方法觀察HpSlyD對胃癌細(xì)胞AGS增殖效應(yīng)的影響。
　　2、通過軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察HpSlyD對AGS細(xì)胞克隆形成能力的影響。
　　3、利用transwell以及western-blot和細(xì)胞免疫熒光檢測MMP-9表達(dá)等方法觀察HpSlyD對AGS細(xì)胞遷移效應(yīng)的影響。
　　4、利用caspase-3活性檢測以及western-b

9、lot檢測caspase-3表達(dá)等方法觀察HpSlyD對AGS細(xì)胞凋亡效應(yīng)的影響。
　　三、幽門螺桿菌SlyD影響胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制
　　1、利用AGS和N87兩種細(xì)胞系進(jìn)一步證實(shí)HpSlyD對胃癌細(xì)胞的增殖作用。
　　2、利用Westernblot檢測HpSlyD對p38、ERK、JNK以及轉(zhuǎn)錄因子NF-KB和IKB蛋白磷酸化表達(dá)水平的影響。
　　3、觀察信號通路特異性抑制劑PD98059和SB203580對胃

10、癌細(xì)胞增殖及信號傳導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白的影響。
　　4、利用TLR4抗體中和TLR4作用后，觀察HpSlyD對p38及ERK信號傳導(dǎo)通路的影響。
　　結(jié)果：
　　一、幽門螺桿菌SlyD蛋白的原核表達(dá)、純化及鑒定
　　1.H.pyloriSlyD測序結(jié)果表明SlyD基因全長564bp，編碼182個(gè)氨基酸，與GenBank中已知其他菌株基因序列的核苷酸同源性為97％。
　　2、成功構(gòu)建了pET28a+-slyD原核

11、表達(dá)質(zhì)粒，DNA測序后與GeneBank公布的基因序列一致。
　　3、成功誘導(dǎo)表達(dá)并純化了SlyD蛋白，經(jīng)Western blot檢測結(jié)果顯示:該重組蛋白可與抗His標(biāo)簽抗體結(jié)合反應(yīng)，經(jīng)AKTAprimeTM plus層析系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)純化后可獲得純度約為97％，相對分子質(zhì)量(Mr)約為34kDa的rSlyD，與預(yù)測結(jié)果一致，蛋白活性檢測其具有PPIase活性。
　　二、幽門螺桿菌SlyD對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　

12、1、不同濃度的幽門螺桿菌重組蛋白SlyD與AGS細(xì)胞作用24、48及72h后，細(xì)胞增殖的程度隨著rSlyD濃度的增加和作用時(shí)間的延長而逐漸增加。
　　Western-blot及細(xì)胞免疫熒光結(jié)果亦顯示，rSlyD可以使PCNA及KI-67的表達(dá)增強(qiáng)。
　　2、集落形成實(shí)驗(yàn)表明，rSlyD處理三周后的AGS細(xì)胞與對照組相比(P＜0.05)形成集落數(shù)最多。
　　3、transwell實(shí)驗(yàn)表明，100ng/ml rSlyD作用

13、于AGS細(xì)胞48h后，發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移的能力(與對照組比較P＜0.05)。此外，Western-blot及細(xì)胞免疫熒光結(jié)果亦顯示:rSlyD可以使MMP-9的表達(dá)增強(qiáng)。
　　4、caspase-3活性檢測及western-blot檢測caspase-3表達(dá)顯示:100ng/mlrSlyD作用于AGS細(xì)胞48h后，具有抑制胃癌細(xì)胞凋亡的能力（與對照組比較 P＜0.05)。
　　三、幽門螺桿菌SlyD影響胃癌細(xì)胞增殖的

14、機(jī)制
　　1、WesternBlot結(jié)果顯示:HpSlyD可以上調(diào)p-p38及p-ERK蛋白表達(dá)的水平而對p-JNK蛋白表達(dá)水平無影響。
　　2、HpSlyD促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖主要是通過激活P38及ERKI/2兩條主要通路。抑制P38和MAPK/ERK通路可部分逆轉(zhuǎn)HpSlyD促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的作用。提示激活P38和MAPK/ERK通路是HpSlyD促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。
　　3、WesternBlot結(jié)果顯示:H

15、pSlyD可以上調(diào)TLR4、p-NF-κB及p-ⅠκB蛋白表達(dá)水平。
　　4、HpSlyD可以引起TLR4表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而激活P38/p-ERK-IKB-NF-KB通路。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建了HpSlyD基因的原核表達(dá)載體，獲得了HpSlyD重組蛋白。
　　2.HpSlyD具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)化，抑制胃癌細(xì)胞凋亡的能力。
　　3.HpSlyD通過上調(diào)TLR4表達(dá)進(jìn)而激活P38/p-ERK-