NOTCH-1在主動(dòng)脈瓣二葉畸形合并主升主動(dòng)脈擴(kuò)張發(fā)生中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　 主動(dòng)脈瓣二葉畸形(BicuspidAorticValve，BAV)是常見(jiàn)的先天性心臟畸形，在普通人群中的發(fā)病率大約在0.46％-1.37％，男女比率約為3:1。BAV患者可終身沒(méi)有癥狀，若是合并主動(dòng)脈病變?nèi)缟鲃?dòng)脈擴(kuò)張(Ascendingaorticdilation，AAD)、升主動(dòng)脈瘤(Ascendingaorticaneurysm，AAA)或主動(dòng)脈夾層(Aorticdissection，AD)，則手術(shù)

2、治療風(fēng)險(xiǎn)和治療費(fèi)用顯著增加，術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率增高。因此探討B(tài)AV合并AAD的發(fā)生機(jī)制，不儀對(duì)疾病的早期診斷、早期治療提供指導(dǎo)，還可以為今后BAV合并AAD的生物治療提供潛在靶點(diǎn)。
　　 目前普遍認(rèn)為，主動(dòng)脈血管中層平滑肌細(xì)胞(Vascularsmoothmusclecell，VSMC)的功能異常與主動(dòng)脈病變的發(fā)生密切相關(guān)。VSMC是血管中層的主要細(xì)胞類(lèi)型，現(xiàn)有研究表明VSMC凋亡、表型轉(zhuǎn)化和高分泌MMPs導(dǎo)致動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)

3、破壞，細(xì)胞遷移增加和細(xì)胞外基質(zhì)降低，最終導(dǎo)致AAD發(fā)生。但是，對(duì)于VSMC功能異常的機(jī)制仍不明確，尤其是BAV合并AAD的具體機(jī)制目前未見(jiàn)報(bào)道。
　　 NOTCH信號(hào)通路是人體內(nèi)高度保守的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)通路，其在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。淋巴瘤、膠質(zhì)瘤、非小細(xì)胞癌和胰腺癌等腫瘤細(xì)胞的凋亡與NOTCH-1基因相關(guān)，當(dāng)NOTCH-1下調(diào)時(shí)，腫瘤細(xì)胞的凋亡增加，這也成為許多腫瘤治療的研究靶點(diǎn)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎心臟

4、發(fā)育過(guò)程中，NOTCH-1在調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymaltransition，EMT)中發(fā)揮重要作用，而EMT是胚胎期瓣膜發(fā)育的重要環(huán)節(jié)。已有研究表明，NOTCH-1基因異常導(dǎo)致信號(hào)傳導(dǎo)障礙不僅導(dǎo)致BAV的發(fā)生，而且與遠(yuǎn)期瓣膜鈣鹽沉積及鈣化相關(guān)。但是NOTCH-1基因的表達(dá)改變是否也調(diào)控VSMC的功能從而影響主動(dòng)脈壁功能以及其中的可能機(jī)制目前尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)回顧本院近

5、20年入院手術(shù)BAV患者的臨床資料，總結(jié)BAV發(fā)病的流行病學(xué)特點(diǎn)，分析其合并癥特別是AAD的臨床特點(diǎn)，研究引起AAD的高危因素，為今后的臨床診治提供依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，以臨床病理及組織標(biāo)本為切入點(diǎn)，分析BAV合并AAD的分子病理學(xué)特征，了解NOTCH-1基因在BAV合并AAD發(fā)病中的作用，并在細(xì)胞學(xué)水平驗(yàn)證NOTCH-1基因改變與血管平滑肌細(xì)胞功能改變的聯(lián)系，提出其可能的分子機(jī)制，為BAV合并AAD的預(yù)防與治療提供理論支持。
　　

6、 研究方法和結(jié)果:
　　 為以上目的，本研究分為以下四個(gè)部分：
　　 1、分析總結(jié)20年在院手術(shù)治療的BAV患者的臨床資料，包括患者性別、年齡、體表面積(BSA)、術(shù)前合并癥、心功能等級(jí)，以及術(shù)前重要的超聲檢查指標(biāo)，根據(jù)瓣膜解剖特點(diǎn)確定分型。分析不同性別及不同瓣膜分型在臨床特點(diǎn)、合并癥方面有無(wú)差異。并在此基礎(chǔ)上，采用二元Logistic回歸分析對(duì)升主動(dòng)脈擴(kuò)張的危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析，得出BAV合并AAD的危險(xiǎn)因素。
　　

7、 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，BAV患者以男性占多數(shù)，主要的臨床合并癥包括瓣膜功能障礙、感染性心內(nèi)膜炎和升主動(dòng)脈病變等。最為常見(jiàn)合并的先天性心臟病為主動(dòng)脈縮窄和室間隔缺損。在瓣膜分型中，以左-右冠瓣融合型(L-R型)最為常見(jiàn)，占63.3％，其次為右-無(wú)冠瓣融合型(R-N型)，占32.8％。全組406例患者在院死亡率為6.2％，要高于同期其他在院因主動(dòng)脈瓣病變手術(shù)患者，合并感染性心內(nèi)膜炎是導(dǎo)致在院死亡率增大因素之一。性別差異影響到BAV患者的臨床特點(diǎn)

8、，入院手術(shù)時(shí)男性患者的年齡明顯低于女性患者，并且男性患者更易合并有SBE。男性患者表現(xiàn)出更差的心臟功能，而女性患者則更常表現(xiàn)出合并有升主動(dòng)脈病變。不同瓣膜分型在臨床特點(diǎn)上也有差異：L-R型患者易同時(shí)累及升主動(dòng)脈，而對(duì)于R-N型患者，瓣膜功能障礙更易出現(xiàn)。通過(guò)Logistic回歸分析，我們發(fā)現(xiàn)年齡增加和女性是BAV合并AAD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　 2、通過(guò)分析BAV患者升主動(dòng)脈標(biāo)本的病理標(biāo)本，總結(jié)其組織學(xué)特征和細(xì)胞外基質(zhì)成分的分子

9、生物學(xué)改變，采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(Terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTP-biotinnickendlabelingassay，TUNEL)染色法檢測(cè)BAV組和TAV組與正常對(duì)照組中主動(dòng)脈壁中層細(xì)胞凋亡率的差異。免疫組化分析基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9(Matrixmetalloproteinase，MMP)的表達(dá)情況，并采用qRT-PCR檢測(cè)標(biāo)本中的NOTC

10、H-1、VSMC分化遷移標(biāo)志蛋白在分子水平表達(dá)情況。最后，根據(jù)NOTCH-1的表達(dá)情況，將BAV合并AAD組分成NOTCH-1表達(dá)正常組和低表達(dá)組，分別比較兩組間細(xì)胞凋亡率、MMP-2，9及VSMC分化標(biāo)志蛋白的表達(dá)差異。
　　 經(jīng)過(guò)研究，我們發(fā)現(xiàn)，相比于正常對(duì)照組，BAV合并AAD患者的主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)破壞、平滑肌細(xì)胞的丟失增多。維多利亞藍(lán)染色(Victoriablue，VB)顯示BAV主動(dòng)脈壁中的紅色膠原纖維含量增高而藍(lán)色的彈力

11、纖維斷裂、含量降低。免疫組化結(jié)果可見(jiàn)BAV和TAV合并AAD患者的MMP-2，9表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組。TUNEL染色見(jiàn)正常主動(dòng)脈壁中僅有少量凋亡細(xì)胞，而在BAV合并AAD組和TAV合并AAD中，凋亡明顯增多，并且主動(dòng)脈擴(kuò)張程度越重，中層VSMC凋亡越多。qRT-PCR檢測(cè)提示，NOTCH-1基因在BAV/N組和BAV/AAD組中明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，在TAV/AAD組中低于對(duì)照組(P<0.05)。代表活化收縮型VSMC的a-

12、SMA和SM22a的表達(dá)明顯降低，而調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分代謝的MMP-2，9則明顯上調(diào)。我們還發(fā)現(xiàn)，NOTCH-1表達(dá)下調(diào)與VSMC凋亡及表型轉(zhuǎn)化相關(guān)。相比與NOTCH-1正常組，在NOTCH-1下調(diào)組中，平滑肌細(xì)胞凋亡率顯著增高，a-SMA和SM22a的表達(dá)顯著降低，但MMP-2，9的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3、為了研究BAV相關(guān)的目的基因。NOTCH-1在調(diào)控VSMC凋亡中的作用機(jī)制，我們首先通過(guò)體外成功培養(yǎng)可用于細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)

13、的VSMC，并采用化學(xué)合成法構(gòu)建NOTCH-1的siRNA，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染成功下調(diào)NOTCH-1表達(dá)。在此基礎(chǔ)上我們通過(guò)Annexin-V/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化，并通過(guò)qRT-PCR和Westernblot分別檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白在mRNA水平和蛋白水平的變化，從不同凋亡通路分析其參與的可能性，從而得出NOTCH-1調(diào)控VSMC凋亡的主要機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比siRNA陰性對(duì)照組，NOTCH-1siRN

14、A轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著提高，凋亡相關(guān)的蛋白也有相應(yīng)的變化。siRNA實(shí)驗(yàn)組的促凋亡蛋白Caspase-9和Bax顯著提高，而抑制凋亡蛋白BCL-2及NF-KappaB顯著降低；另一方面Caspase-8的表達(dá)也有升高，但不如其他凋亡蛋白的表達(dá)變化程度大。因此，我們認(rèn)為，NOTCH-1調(diào)控VSMC凋亡主要通過(guò)線粒體途徑完成，但也不排除受體介導(dǎo)途徑在其中的作用。
　　 4、我們?cè)隗w外培養(yǎng)大鼠VSMC及轉(zhuǎn)染NOTCH-1siRNA的基

15、礎(chǔ)上，采用qRT-PCR和Westernblot方法檢測(cè)NOTCH-1siRNA組和陰性轉(zhuǎn)染組間VSMC表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志基因a-SMA和SM22a的表達(dá)差異，分析NOTCH-1基因下調(diào)對(duì)VSMC分化的影響。利用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)研究分析VSMC遷移能力的變化，同時(shí)檢測(cè)MMP-2，9的表達(dá)情況，分析MMPs表達(dá)受NOTCH-1下調(diào)的影響及其對(duì)VSMC遷移能力的影響。
　　 通過(guò)研究我們發(fā)現(xiàn)，NOTCH-1下調(diào)后可誘導(dǎo)VSMC由

16、收縮亞型向合成亞型轉(zhuǎn)化，a-SMA和SM22a的表達(dá)在siRNA組中顯著下降。伴隨著NOTCH-1表達(dá)下調(diào)，VSMC細(xì)胞遷移能力增加，但影響細(xì)胞遷移能力的MMP-2，9并無(wú)顯著上升，提示NOTCH-1調(diào)控VSMC遷移能力改變主要是通過(guò)改變細(xì)胞的分化狀態(tài)而不是通過(guò)影響MMPs的表達(dá)，NOTCH-1對(duì)MMP-2，9的表達(dá)無(wú)直接的調(diào)控作用。
　　 結(jié)論:
　　 1、BAV患者男女比例約為2.6:1，最常見(jiàn)的合并癥有瓣膜功能異常

17、、感染性心內(nèi)膜炎(12.5％)，升主動(dòng)脈擴(kuò)張(44.1％)。伴發(fā)最常見(jiàn)的先天性心臟病為主動(dòng)脈縮窄和室間隔缺損。在二葉瓣分型中最常見(jiàn)的是L-R融合型(占63.3％)，其次為R-N融合型(占32.8％)；
　　 2、男性BAV患者更易發(fā)生AI，且易并發(fā)感染性心內(nèi)膜炎；而女性患者更易發(fā)生AS。女性患者更加容易并發(fā)升主動(dòng)脈擴(kuò)張。L-R型BAV患者易并發(fā)升主動(dòng)脈擴(kuò)張和主動(dòng)脈竇部擴(kuò)張，并且更易出現(xiàn)AI，而R-N型患者更易發(fā)展成為AS合并AI

18、；
　　 3、影響B(tài)AV患者合并升主動(dòng)脈的獨(dú)立危險(xiǎn)因素包括年齡增加和女性，因合并感染性心內(nèi)膜炎而早期就診是起到一定保護(hù)性作用；
　　 4、BAV合并AAD的基本組織病理改變是中層囊性壞死，包括平滑肌細(xì)胞腫脹、變性、缺失，彈力蛋白斷裂、消失，且病理改變的嚴(yán)重程度與主動(dòng)脈擴(kuò)張的程度存在一定的關(guān)聯(lián)；
　　 5、NOTCH-1表達(dá)下調(diào)、VSMC的凋亡增加及表型轉(zhuǎn)化、MMP-2，9的表達(dá)與BAV合并AAD的發(fā)生具有相關(guān)性；

19、
　　 6、NOTCH-1的表達(dá)下調(diào)與VSMC凋亡增加、表型轉(zhuǎn)化具有相關(guān)性；
　　 7、NOTCH-1表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)VSMC凋亡增加，線粒體凋亡通路的相關(guān)蛋白表達(dá)有顯著差異提示其發(fā)揮了重要作用，但不排除受體介導(dǎo)通路在其中發(fā)揮的作用。
　　 8、NOTCH-1表達(dá)下調(diào)可誘導(dǎo)VSMC由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，收縮型VSMC的標(biāo)志蛋白a-SMA和SM22A表達(dá)下調(diào)；
　　 9、NOTCH-1對(duì)MMP-2，9的表達(dá)沒(méi)