A549細胞中TrkB激活的調(diào)控機制研究.pdf

1、目的：
　　1，探討STAT3活性是否參與A549中TrkB的激活。
　　2，探討B(tài)DNF-TrkB信號是否影響STAT3活性及下游信號。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)與處理
　　人類的肺腺癌細胞系A(chǔ)549用Dulbecco's modified Eagle's培養(yǎng)基(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)加入10％胎牛血清(Invitrogen)和5mM谷氨酰胺，培養(yǎng)在37℃，飽和濕度，5

2、％二氧化碳培養(yǎng)箱中。
　　2.蛋白免疫印跡(WB)
　　通過免疫印跡測定目的蛋白質(zhì)的含量。簡言之，等量的蛋白質(zhì)（10μg/每個上樣孔）被SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移到0.22um PVDF膜上(Bio-Rad Inc.)。將膜孵育在封閉液中(0.2mM Tris，137mM Nacl，5％脫脂牛奶以及0.1％Tween-20)一個小時，然后放在4℃抗體中過夜。用TBST緩沖液(0.1％ Tween-20，0.2mM Tri

3、s，137mM NaCl)沖洗PVDF膜后，在室溫下孵育HRP-結(jié)合的二抗(1∶5000)一個小時，然后進行ECL化學(xué)發(fā)光檢測。
　　3.實時定量PCR反應(yīng)
　　腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成是通過定量RT-PCR來衡量的。細胞用PBS沖洗后，提取RNA。根據(jù)操作說明用TRNzol-A+RNA提取試劑(TIANGEN)提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄1μg的總RNA和RevertAid First Strand cDNA Synthesis試

4、劑盒(Fermentas)。實時定量PCR使用SYBR GREEN(Roche)進行(MyiQ2Bio-Rad)檢測。用2-△△CT方法將每個孔的BDNFmRNA水平標準化。每個實驗重復(fù)三次。
　　4.統(tǒng)計分析
　　顯著性差異統(tǒng)計使用T檢驗和方差分析（方差分析）方法。數(shù)據(jù)顯示用mean±SEM表示，p＜0.05被認為是有顯著變化的。所有的實驗都重復(fù)三次。
　　結(jié)果：
　　1.TrkB在人類肺癌細胞株A549中表達

5、，并存在組成型激活
　　為了檢測TrkB的表達和激活，本實驗用免疫印跡分析(WB)檢測不同條件下A549細胞裂解液。分別用pan-TrkB抗體檢測TrkB蛋白表達，用phospho-Trk抗體檢測激活的TrkB。在肺癌細胞中加入BDNF刺激1h作為陽性對照。結(jié)果顯示，TrkB在A549細胞中存在表達和組成型激活。在A549細胞中，只有145kD的TrkB-FL亞型的表達，沒有TrkB.T1的表達。我們發(fā)現(xiàn)，在A549細胞無血清饑餓

6、1h后TrkB磷酸化水平顯著降低，而A549細胞無血清饑餓24小時后TrkB的磷酸化水平又恢復(fù)到饑餓前水平。在血清饑餓的條件下TrkB的磷酸化可以自發(fā)恢復(fù)，提示我們可能有配體BDNF自分泌機制的存在。為了確認這種可能性，我們檢測在A549細胞中是否存在BDNF的表達。結(jié)果表明A549存在內(nèi)源性BDNF的表達。這一發(fā)現(xiàn)證明了在A549細胞中BDNF作為主要因素激活TrkB。
　　2.在A549細胞中STAT3轉(zhuǎn)錄因子是BDNF表達的

7、主要影響分子
　　為了研究在無血清的條件下STAT3是否激活，我們進行了免疫印跡分析法測定STAT3磷酸化水平。在A549細胞中，存在Stat3酪氨酸磷酸化以及絲氨酸磷酸化，1h的血清饑餓可以降低STAT3的磷酸化，但24h血清饑餓后，STAT3的磷酸化水平與對照組相比都升高。和Stat3酪氨酸磷酸化相一致的是，特異性的STAT3抑制劑——Sattic預(yù)處理A549，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA和蛋白水平都顯著降低。在無血清條件下，

8、Star3活性被Sattic抑制能阻斷A549細胞中BDNF在血清饑餓后的自發(fā)恢復(fù)。結(jié)果提示我們，在A549細胞中STAT3影響B(tài)DNF的表達。
　　3.在A549細胞中BDNF是Stat3活性的一個重要的調(diào)節(jié)因子
　　據(jù)先前的研究報道，STAT3同時是BDNF及其受體TrkB的下游信號目標。在A549細胞中，為了研究STAT3活性是否也受BDNF及其受體TrkB調(diào)節(jié)，在細胞水平，我們檢測了存在Trk的抑制劑K252a時，S

9、TAT3的磷酸化水平。結(jié)果表明，阻斷TrkB活性通路可以顯著減少STAT3的磷酸化水平;而更多的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子可能進一步激活STAT3。為了檢測在A549細胞中無血清條件下，STAT3活性的恢復(fù)是否依賴BDNF;我們在無血清條件下加入K252a后處理12 h;此時A549細胞被檢測出STAT3的磷酸化水平低于沒有加入K252a情況。結(jié)果表明，A549細胞在無血清條件下阻斷TrkB活性可能放緩STAT3的自發(fā)恢復(fù)。這一發(fā)現(xiàn)強烈提示，在

10、A549細胞中BDNF增強STAT3活性。
　　4.STAT3誘導(dǎo)的BDNF表達參與Akt蛋白激酶的激活
　　為了檢驗是否STAT3誘導(dǎo)BDNF表達與TrkB及其下游信號通路激活有關(guān)，我們檢測了STAT3抑制劑是否影響AKT的活性。AKT是當(dāng)細胞暴露于凋亡刺激下，重要的反應(yīng)蛋白之一。我們分別加入K252a和Satic抑制劑處理細胞，然后我們檢測Akt蛋白激酶的磷酸化水平。如圖所示，再加入Sattic或K252a處理后，細胞中

11、Akt磷酸化水平減少。結(jié)果表明，BDNF/TrkB和STAT3活性都與Akt蛋白激酶的激活相關(guān)。更重要的是，外源加入K252a不能進一步降低Sattic處理的細胞中Akt蛋白激酶的磷酸化水平。這些結(jié)果證明了STAT3誘導(dǎo)的BDNF表達參與Akt蛋白激酶的激活。
　　結(jié)論：
　　肺癌是目前全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一。在所有肺癌中，非小細胞肺癌(NSCLC)占到80％。而且NSCLC的發(fā)病率幾年來仍在上升。非小細胞肺癌往

12、往對現(xiàn)有化療藥物不敏感，因此進一步了解哪些分子參與了非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展調(diào)控，具有重要的價值。
　　腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)素超家族一員，在神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能研究中，都顯示出重要功能。最近，一些研究表明，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體TrkB可能參與一些惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，如神經(jīng)母細胞瘤、胰腺導(dǎo)管癌、前列腺癌、肝細胞癌和肺癌等。然而目前在非小細胞肺癌中如何引起TrkB下游信號激活的分子機制尚不清楚。
　　本

13、研究以非小細胞肺癌中常見的細胞模型——A549細胞為主要研究材料，研究了非小細胞肺癌中，BDNF激活及調(diào)控的機制。本研究主要有以下三個方面的發(fā)現(xiàn):
　　首先，本研究發(fā)現(xiàn)A549中TrkB的激活可以依賴其自分泌的BDNF實現(xiàn)，而不是依賴微環(huán)境中旁分泌的BDNF。而且表明這種BDNF的自分泌調(diào)控，依賴STAT3的活性。以往研究顯示，在非小細胞肺癌中，存在TrkB表達的增加，以及外源加入BDNF可以增加TrkB的活性，及影響下游功能，但

14、沒有研究體內(nèi)情況下，TrkB的激活所需的配體從何而來。本實驗通過RT-PCR及WB實驗，證明A549細胞中，存在BDNF的內(nèi)源性表達，而且這種內(nèi)源性表達的BDNF參與了TrkB活性的調(diào)控。研究顯示，A549細胞內(nèi)，BDNF的調(diào)控受到STAT3的調(diào)控。STAT3在多種腫瘤調(diào)控中起到關(guān)鍵的作用，并且已經(jīng)被報道參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展。我們的研究顯示，抑制STAT3的活性，可以顯著減少BDNF的合成，提示STAT3是BDNF合成分泌重要的調(diào)控因子

15、。
　　第二，本研究發(fā)現(xiàn)BDNF/TrkB信號可以進一步上調(diào)STAT3的活性，而這種上調(diào)進一步增加了BDNF的表達及分泌，以及TrkB的激活。我們研究發(fā)現(xiàn)，不僅STAT3可以調(diào)控BDNF的合成，BDNF/TrkB活性可以反過來調(diào)控STAT3的活性。而這種BDNF引起的STAT3活性上調(diào)，進一步促進了BDNF的合成釋放。這形成了一個典型的正反饋調(diào)控，可能是導(dǎo)致肺癌細胞中STAT3及TrkB活性大量增強的原因之一。
　　第三，本

16、研究發(fā)現(xiàn)這種STAT3依賴BDNF分泌的正反饋調(diào)控，影響了A549細胞中PI3K-AKT信號通路的激活。結(jié)果顯示，在A549中，阻斷STAT3可以引起AKT磷酸化水平的下降，而這種下降不會因為Trk活性的抑制而更低。提示了STAT3對于AKT的活性調(diào)控，可能是由于對BDNF合成的調(diào)控所引起的。也就是說，STAT3依賴的BDNF分泌的正反饋調(diào)控，影響了A549細胞中PI3K-AKT信號通路的激活。
　　意義:
　　在本研究中，